細(xì)胞凍存的必要性：

首先，細(xì)胞培養(yǎng)過程中，考慮到細(xì)胞株傳代次數(shù)逐漸增加后，細(xì)胞變異的可能性將增大，繼續(xù)培養(yǎng)的話細(xì)胞株可能會出現(xiàn)老化、狀態(tài)下降、丟失一些該細(xì)胞的特性的現(xiàn)象，對后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成影響；

此外，如果該細(xì)胞株特別珍貴，屬于實(shí)驗(yàn)室重要資源，對細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模的保存，能有效降低課題項目執(zhí)行的風(fēng)險;

最后，就是常見的風(fēng)險規(guī)避問題，正所謂人有失手、馬有失蹄，再熟練的實(shí)驗(yàn)操作者、再厲害的實(shí)驗(yàn)設(shè)備也是有出問題的可能，一旦出問題，意味著細(xì)胞資源的損失。

基于以上幾點(diǎn)，細(xì)胞凍存對于一個實(shí)驗(yàn)室或個人來說，是非常必要的操作。

實(shí)驗(yàn)原理：

隨著溫度降低，細(xì)胞內(nèi)的酶活性會逐漸降低，到-70℃左右，酶活性幾乎為0，代謝活動停止，可以實(shí)現(xiàn)長期保存。然而，隨著溫度降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分也會“結(jié)冰"并形成冰晶，冰晶能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。因此常加入冷凍保護(hù)劑甘油或二甲基亞砜（DMSO）。DMSO能快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，降低冰點(diǎn)，延緩凍存過程，同時增加細(xì)胞膜的通透性，提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。

儀器和試劑：

1. 儀器：細(xì)胞計數(shù)儀、臺式離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、移液槍、移液管移液器、4℃和-20℃冰箱、-80℃超低溫冰箱、程序降溫盒、標(biāo)簽打印機(jī)、凍存管、液氮罐

2. 試劑：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS、PBS、DMSO、胰酶

實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 制備凍存液，凍存液比例：本實(shí)驗(yàn)室采用70%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO，不同實(shí)驗(yàn)室及不同細(xì)胞可能略有差異，也可采用55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%FBS+5%DMSO；

2. 取形態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，對其消化、離心 (1500rpm離心8min)、計數(shù)；

3. 根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入對應(yīng)的凍存液，使細(xì)胞密度維持在300-500w/mL；

4. 小心用鑷子打開凍存管管蓋，每管分裝1-1.5mL含細(xì)胞的凍存液，擰緊蓋管，做好標(biāo)記。

5. 分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒后直接放-80℃過夜；

6. 若沒有程序降溫盒，則按下列順序依次降溫：室溫→4℃20min→-20℃30min→-80℃過夜，注意轉(zhuǎn)移過程中要保冷，避免產(chǎn)生溫差或凍存管融化；

7. 從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉(zhuǎn)移到液氮長期保存。

注意事項：

1. 細(xì)胞凍存原則為“慢凍"，即讓細(xì)胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍。當(dāng)細(xì)胞快速冷凍時，水和離子往往會留在細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成會撕裂和刺穿細(xì)胞膜。相反，如果細(xì)胞冷凍太過緩慢，則細(xì)胞外的水會在細(xì)胞內(nèi)冰形成之前結(jié)冰。這允許水通過滲透作用逸出，但增加了可能有毒的細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度。因此對于大多數(shù)細(xì)胞，最佳冷凍速率在每分鐘1℃之間。

2. DMSO能夠快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，延緩溫度下降速度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。

3. 凍存可用10%～90%的血清，一般高濃度血清有助于維護(hù)細(xì)胞活力，此處介紹20%終濃度有利于細(xì)胞懸浮而少沉積(4℃時)，復(fù)蘇存活率在80%～90%，對原代培養(yǎng)細(xì)胞，以90%血清凍存更為有效。

4. 細(xì)胞離心后盡量吸干凈上清液，減少培養(yǎng)基殘留，避免稀釋凍存液。

5. DMSO溶于培養(yǎng)基時，將釋放大量熱量，所以細(xì)胞凍存液需提前配制，冷卻后再使用，不能直接將DMSO加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，避免燙傷細(xì)胞。

6. 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過程中，不可避免會損失部分細(xì)胞，所以凍存的密度不能太低。推薦密度為300-500w/mL。

7. 細(xì)胞懸液加入凍存液以后盡量短時間的在常溫放置，DMSO常溫下對細(xì)胞損傷大，分裝完成后立即轉(zhuǎn)入程序降溫盒。