小鼠elisa試劑盒醫(yī)學(xué)院研究 ：目的本文通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察氟影響下成骨細(xì)胞中刺猬蛋白（Hedgehog, Hh）信號(hào)通路分子及其下游成骨相關(guān)因子、凋亡相關(guān)因子的表達(dá)變化，討論Hh信號(hào)特異性阻斷劑環(huán)巴胺（Cyclopamine, Cycl）的阻斷效果；并檢測(cè)氟中毒大鼠骨組織中與骨髓微環(huán)境相關(guān)的細(xì)胞因子變化情況，深入探討氟影響大鼠骨骼病變時(shí)Hh信號(hào)變化與骨形成增強(qiáng)的關(guān)系，為氟骨癥治療靶點(diǎn)的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1、不同濃度的含氟水飼養(yǎng)大鼠6個(gè)月，觀察氟斑牙發(fā)生情況及測(cè)定尿氟含量，明確氟中毒大鼠模型建立成功后，檢測(cè)各組大鼠骨氟含量。光鏡觀察骨組織病理形態(tài)學(xué)改變；抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）鑒定破骨細(xì)胞并計(jì)數(shù)。酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-LinkedImmunosorbnent Assay, ELISA）檢測(cè)各組大鼠血清骨堿性磷酸酶（Bone alkalinephosphatase, BALP）和抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acidphosphataseform5b, TRACP5b）含量；免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry,IHC）觀察Hh信號(hào)分子和成骨、破骨相關(guān)因子的定位及表達(dá)情況，探討Hh信號(hào)變化與骨形成、骨吸收間的關(guān)系。2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-timefluorescence quantitative PCR, real-time PCR）、IHC和蛋白印跡（Western Blot）檢測(cè)氟中毒大鼠骨組織Hh信號(hào)通路中主要因子的mRNA和蛋白表達(dá)情況，觀察高低劑量氟對(duì)Hh信號(hào)變化的影響。3、給予高氟組大鼠Cycl腹腔注射，觀察Cycl阻斷后大鼠氟斑牙、尿氟和骨氟含量、血清BALP含量變化情況。細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑盒（cell counting kit8, CCK8）篩選出體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞時(shí)氟和Cycl的*藥效濃度，偶氮偶聯(lián)法（p-nitrophenyl phosphate，pNPP法）測(cè)定培養(yǎng)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶（alkaline phhosphatase, ALP）活性。原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（Transferase-mediated dUTP-bintin, TUNEL）定位并計(jì)數(shù)骨組織中凋亡成骨細(xì)胞個(gè)數(shù)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)成骨細(xì)胞凋亡率。Real-timePCR、IHC和Western Blot檢測(cè)動(dòng)物模型和培養(yǎng)成骨細(xì)胞中Hh信號(hào)通路主要分子、其下游成骨相關(guān)因子及凋亡相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)一步探討Cycl對(duì)氟暴露下培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞Hh信號(hào)的阻斷效果及對(duì)成骨細(xì)胞增生的影響。4、Real-time PCR、原位雜交（in situ hybridization, ISH）和IHC檢測(cè)氟中毒大鼠骨組織與骨髓微環(huán)境相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA和蛋白表達(dá)，探討氟中毒大鼠骨骼損傷時(shí)Hh信號(hào)與骨髓微環(huán)境變化的聯(lián)系。結(jié)果1、慢性氟中毒大鼠氟斑牙發(fā)生率、尿氟和骨氟含量、血清BALP含量隨染氟劑量的增加而逐漸增加，提示慢性氟中毒大鼠模型建立成功。氟中毒大鼠骨組織呈骨質(zhì)硬化表現(xiàn)。2、氟中毒組大鼠Hh信號(hào)通路因子印度刺猬蛋白（Indian hedgehog,Ihh）和音速刺猬蛋白（Sonic hedgehog, Shh）及骨形成相關(guān)因子Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor2, Runx2）和成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子（Osterix, Osx）蛋白表達(dá)隨染氟程度加重呈逐漸增強(qiáng)。但破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清TRACP5b、骨吸收相關(guān)因子核因子κB受體活化因子配體（receptor activatorfor nuclear factor-kappa B ligand, RANKL）和細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factorkappa B, NF-κB）p50蛋白表達(dá)則在低氟組升高較高氟組明顯。氟影響下，Hh信號(hào)因子變化與骨形成間呈正相關(guān)性。3、氟中毒組大鼠骨組織中Hh信號(hào)通路的配體（Ihh、Shh）、跨膜蛋白（Smoothened，Smo）及核轉(zhuǎn)錄因子神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白1（Glioma-associated oncogene homolog, Gli1）、Gli2mRNA和蛋白表達(dá)也較對(duì)照組表達(dá)增強(qiáng)，呈劑量依賴性；跨膜蛋白受體（Ptched1，Ptch1）和核轉(zhuǎn)錄因子Gli3的mRNA和蛋白表達(dá)則在各組間比較無(wú)明顯差異。4、應(yīng)用Cycl阻斷處理后，大鼠氟斑牙發(fā)生率、尿氟和骨氟含量與氟中毒組比較無(wú)明顯差異。氟+Cycl處理組大鼠血清BALP含量較氟中毒組降低；培養(yǎng)細(xì)胞中，經(jīng)氟和Cycl處理后ALP活性亦降低。Cycl處理后的大鼠骨組織及培養(yǎng)成骨細(xì)胞中Ihh、Shh、Smo、Gli1、Gli2mRNA和蛋白表達(dá)較氟中毒組表達(dá)減弱，Hh信號(hào)通路下游的成骨相關(guān)因子Runx2和β鏈蛋白（β-catenin）表達(dá)也較氟中毒組減弱，Osx則與氟中毒組無(wú)明顯差異。5、氟中毒大鼠成骨細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率增加，但經(jīng)Cycl處理后變化不明顯；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，2.5mg/L NaF處理組成骨細(xì)胞凋亡率較5mg/L NaF處理組升高更明顯。經(jīng)氟處理后再用Cycl阻斷，細(xì)胞凋亡率較加氟處理組升高。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，氟暴露可致大鼠成骨細(xì)胞中B細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell Lymphoma-2,Bcl-2）表達(dá)降低、Bcl-2基因相關(guān)X蛋白（Bcl-2accociated X protein, Bax）表達(dá)增強(qiáng)、Bcl-2/Bax比值降低。再經(jīng)Cycl處理后，Bcl-2、Bax表達(dá)和Bcl-2/Bax比值與氟中毒組比較變化不大。體外實(shí)驗(yàn)則顯示，與氟處理組比較，氟+Cycl處理后Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)、Bax表達(dá)降低、Bcl-2/Bax比值升高。6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）和IL-6可在慢性氟中毒大鼠成骨細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)，三者的mRNA和蛋白表達(dá)隨染氟增加而增強(qiáng)，但I(xiàn)L-1β和IL-6在低氟組和高氟組間比較無(wú)明顯差異。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNFα）在成骨細(xì)胞中未見陽(yáng)性表達(dá)，在巨核細(xì)胞中呈弱陽(yáng)性表達(dá)，各組間比較表達(dá)強(qiáng)度無(wú)明顯變化。骨氟、Ihh表達(dá)與TGF-β1、IL-1β和IL-6表達(dá)間均呈正相關(guān)性，骨氟、Ihh表達(dá)與TNFα表達(dá)間無(wú)明顯相關(guān)性。結(jié)論1、在一定劑量氟暴露下，大鼠骨形成強(qiáng)于骨吸收，骨組織呈骨質(zhì)硬化表現(xiàn)。BALP可作為一個(gè)判斷氟致骨質(zhì)硬化的早期生物學(xué)指標(biāo)。2、氟可刺激大鼠成骨細(xì)胞Ihh表達(dá)增加，此信號(hào)經(jīng)由Smo介導(dǎo)，激活Gli2后將信號(hào)轉(zhuǎn)錄入細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)Runx2表達(dá)，使成骨細(xì)胞增生、BALP活性增強(qiáng)，終導(dǎo)致大鼠骨組織出現(xiàn)了骨質(zhì)硬化表現(xiàn)。與此同時(shí)，氟致Hh信號(hào)活化可經(jīng)由Bcl-2介導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，凋亡產(chǎn)物又可進(jìn)一步刺激成骨細(xì)胞增殖過(guò)程。3、Cycl對(duì)氟致Ihh信號(hào)活化有一定抑制作用，在體外實(shí)驗(yàn)中可抑制成骨細(xì)胞增生，為氟骨癥治療藥物的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4、Ihh信號(hào)影響骨髓微環(huán)境的Hedgehog信號(hào)在慢性氟中毒大鼠骨骼損傷中的作用機(jī)制及其與骨髓微環(huán)境變化的關(guān)系變化，在一定程度上參與到氟骨癥骨質(zhì)硬化的發(fā)病機(jī)制中。