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?PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要注意的問(wèn)題
閱讀:2235 發(fā)布時(shí)間:2021-10-81、如何確定引物的濃度?
前面我們說(shuō)到,引物一般交由試劑公司合成,有時(shí)候具體的濃度我們也不能確定。有些人喜歡稀釋十倍,有些人喜歡稀釋二十倍。我個(gè)人認(rèn)為比較穩(wěn)妥的做法是在每次拿到反轉(zhuǎn)的 cDNA 后,先會(huì)稀釋 3 倍左右,然后利用管家基因做一次 RT-PCR,循環(huán)數(shù)一般為 25 循環(huán),鑒定一下具體濃度,再?zèng)Q定最后的稀釋倍數(shù)。
2、合成的引物是我們想要的引物嗎?
一般來(lái)說(shuō)在拿到很多引物的時(shí)候,可以通過(guò)普通的 PCR 看看是否是單一條帶,鑒定一下引物的特異性。如果實(shí)驗(yàn)室不差錢,則可以通過(guò)溶解曲線對(duì)所有的引物的特異性做一次鑒定。
3、操作過(guò)程中需要注意哪些問(wèn)題?
一定要戴手套,戴手套,戴手套,重要的事情說(shuō)三遍。根據(jù)經(jīng)驗(yàn),少量模板的加入,容易造成加樣誤差。所以為了盡量減少加入少量模板造成的誤差,我們一般會(huì)將樣本再稀釋一倍,加樣的時(shí)候多加一倍,減少 H2O 的加入量。
4、你確定你的 PCR 板和儀器配套嗎?
你用的是 BIO-RAD 公司的定量 PCR 儀器,那么你一定要買配套該儀器的 qRT-PCR 板。因?yàn)椴患嫒莸?PCR 板會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏差。這種狀況實(shí)驗(yàn)小白尤其需要注意。
5、凝膠放入電泳槽有什么注意事項(xiàng)嗎?
凝膠放入電泳槽時(shí)一定要注意方向,核酸是帶負(fù)電的,所以電泳的方向是從負(fù)極向正極跑,因此,加樣孔一定要對(duì)著負(fù)極放置,不然樣本就跑到膠外面去了。