聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（Polymerase chain raction ,PCR）是一種在體外擴(kuò)增特定DNA片段的方法，具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點(diǎn)，可用很短時間使目的基因或某一片段擴(kuò)增十萬乃至幾百萬倍。

一、PCR常見類型

常規(guī)PCR：

直接PCR是指直接從樣品擴(kuò)增目標(biāo)DNA，無需進(jìn)行核酸分離純化。

熱啟動PCR：

熱啟動PCR常用于增強(qiáng)PCR擴(kuò)增的特異性。該方法主要利用抗體、親合配體、適體或化學(xué)修飾物等酶修飾酶，來抑制室溫下的DNA聚合酶的活性。這種修飾使得在PCR體系配制階段引物與模板、引物與引物之前的結(jié)合能力降低，從而避免了非特異性擴(kuò)增。

巢式PCR：

巢式PCR是標(biāo)準(zhǔn)PCR的一種演變，其增強(qiáng)了反應(yīng)特異性和目標(biāo)擴(kuò)增子的產(chǎn)量。

快速PCR：

在快速PCR中，通過縮減PCR步驟所需時間來完成更快的擴(kuò)增，且不會影響擴(kuò)增產(chǎn)量和效率?？焖傺h(huán)條件尤其適用于具有高擴(kuò)增能力的DNA聚合酶，這類聚合酶在每個結(jié)合中可引入更多的核苷酸。

高GC含量PCR：

具有高GC含量（>65%）的DNA模板由于G和C堿基間的強(qiáng)氫鍵影響，比較難以擴(kuò)增。富含GC的序列同時也涉及二級結(jié)構(gòu)。因此，富含GC的序列可導(dǎo)致DNA聚合酶沿模板擴(kuò)增時“卡頓"并干擾DNA合成。

多重 PCR:

多重PCR可在同一PCR反應(yīng)管中同時擴(kuò)增多個不同的片段。多種PCR不僅意味著節(jié)省時間、試劑和樣品，還能夠同時對比多個擴(kuò)增子

長片段 PCR:

長片段PCR通常是指擴(kuò)增大于5kb的DNA片段。長片段PCR傳統(tǒng)上使用 Taq DNA 聚合酶（用于快速延伸）和高保真酶（用于提高準(zhǔn)確性）的混合物。

定量PCR:

序列的擴(kuò)增程度（得率）取決于模板起始量，PCR常用于對樣品中的DNA進(jìn)行定量，其中，最常見的應(yīng)用是 基因表達(dá)定量。

二、PCR反應(yīng)基本步驟

變性：根據(jù)DNA高溫變性的原理，將反應(yīng)體系溫度升至變性溫度（高于模板熔點(diǎn)，約95℃），使目的DNA雙鏈裂解成PCR模板（單鏈）。[95℃，30s]

退火：將反應(yīng)體系溫度驟降至退火溫度（低于引物熔點(diǎn)約55℃），是PCR引物與PCR模板3’端雜交，稱為退火。[55~65℃，30s]

延伸：將反應(yīng)體系溫度升至延伸溫度（約72℃），DNA聚合酶按照堿基配對原則在引物3’端以5’→3’方向催化合成PCR模板新的互補(bǔ)鏈，使目的DNA拷貝數(shù)增加1倍。[72℃，30~60s]