實時熒光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中的每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時監(jiān)測從而實現(xiàn)對起始模板的定性及定量分析。

 

1.在qPCR 技術(shù)中重要的參數(shù)指標(biāo)有哪些？

   擴(kuò)增及溶解曲線：擴(kuò)增曲線是PCR過程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)所繪制的曲線。主要用于反映qPCR的動態(tài)進(jìn)程；溶解曲線是用來驗證擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的，如果產(chǎn)物是單一條帶，溶解曲線就會出現(xiàn)單峰，如果有引物二聚體或其它非特異性擴(kuò)增，就會出現(xiàn)至少兩個峰。

 

  熒光域值（threshold）: 是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold。

 

  Ct 值：是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋進(jìn)行qPCR，按照起始DNA量由多到少的順序等間隔得到一系列擴(kuò)增曲線。Ct值與起始模板數(shù)的對數(shù)值之間存在線性關(guān)系，可以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知濃度的樣品也得到Ct值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以求出未知樣品的起始模板量。

2.擴(kuò)增曲線一般分為哪幾個階段：

  熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。在qPCR擴(kuò)增早期，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化，此時即為基線期，

 

PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，zui終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板，從而進(jìn)入平臺期，在該時期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系，只有在熒光信號的指數(shù)增長期，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。

3.ROX染料的作用

ROX（Passive Reference Dye）是一種惰性參比染料，在qPCR反應(yīng)中能被qPCR儀檢測到。ROX不參與qPCR反應(yīng)，熒光信號值不會隨著qPCR擴(kuò)增而改變。實驗過程中很多因素會引起孔間差異：不均勻的照明，孔與孔之間光學(xué)因素（液滴、氣泡）的因素，反應(yīng)體系的濃度不同…… 可以用ROX作為陽性參比，對其他熒光信號進(jìn)行歸一化校正，以提高數(shù)據(jù)的較精確度。

 

4.Ct值多少才算理想

一般來說Ct值在30以下都可以說實驗結(jié)果是可靠的，30以上基本可以說明該基因沒有擴(kuò)增，但也不是的，需要輔以溶解曲線加以解釋。