穩(wěn)定細(xì)胞株是一種常用于基因表達(dá)、藥物篩選和蛋白質(zhì)表達(dá)等領(lǐng)域的工具。但是，穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選需要經(jīng)過(guò)一系列的步驟和實(shí)驗(yàn)，下面介紹一下穩(wěn)定細(xì)胞株篩選的兩種方法和穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選簡(jiǎn)要步驟：

一、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法
先把質(zhì)粒整合到染色體上后，用相應(yīng)的質(zhì)粒DNA中的抗性標(biāo)志來(lái)篩選該細(xì)胞系，單克隆篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。
1、篩選濃度測(cè)定，以10~14 天細(xì)胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度；
2、進(jìn)行細(xì)胞接種，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前天接種細(xì)胞，各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長(zhǎng)率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)到60%~80% 覆蓋；
3、進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染
4、利用質(zhì)粒上含有的抗性選擇進(jìn)行篩選，并鑒定篩選結(jié)果。

二、慢病毒轉(zhuǎn)染法：
應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒轉(zhuǎn)染，篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。慢病毒可以攜帶外源基因隨機(jī)整合進(jìn)基因組。轉(zhuǎn)染得到穩(wěn)定細(xì)胞株的效率高，是建立穩(wěn)定株的比較不錯(cuò)的方式。
1、將人源化的抗體基因轉(zhuǎn)接到慢病毒載體上，
2、使用包裝細(xì)胞，一般為293細(xì)胞，包裝出病毒，不同類型病毒包裝時(shí)間一般在3-5天。
3、用病毒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。包裝好的病毒要先測(cè)滴度，根據(jù)滴度決定轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞的病毒量。
4、后期篩選。轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞1-2天后加抗生素篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞株。

穩(wěn)定細(xì)胞株篩選步驟：
1.構(gòu)建攜帶目標(biāo)基因的載體
首先，需要將目標(biāo)基因克隆到攜帶有選擇標(biāo)記的載體中，例如含有抗生素抗性基因的質(zhì)粒。然后將該載體轉(zhuǎn)染到目標(biāo)細(xì)胞中。

2.選擇標(biāo)記篩選
轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞需要在含有抗生素的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。只有成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞才能夠在含有抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

3.穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選
在完成了選擇標(biāo)記篩選后，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，以得到穩(wěn)定的細(xì)胞株。這可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行單克隆分離來(lái)實(shí)現(xiàn)。具體地，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在96孔板中進(jìn)行單克隆分離，每個(gè)孔只保留一個(gè)細(xì)胞。然后，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞株的表達(dá)水平和穩(wěn)定性，篩選出較佳的穩(wěn)定細(xì)胞株。

總結(jié)：
穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要仔細(xì)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)。通過(guò)上述步驟，可以篩選出高表達(dá)、穩(wěn)定的細(xì)胞株，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)和研究提供了有力的支持。

細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建病毒法：

1、確定目標(biāo)細(xì)胞系的相關(guān)信息，細(xì)胞的培養(yǎng)條件，細(xì)胞的增值速度，支原體污染情況；

2、預(yù)實(shí)驗(yàn)確定MOI值，可通過(guò)查閱文獻(xiàn)確定慢病毒在目標(biāo)細(xì)胞系中的MOI值也可參考查閱得到的數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)梯度實(shí)驗(yàn)，摸索最適MOI；

3、預(yù)實(shí)驗(yàn)確定篩選藥物用量，常用的藥物篩選有：puro、G418、潮霉素等；

    4、 細(xì)胞鋪板，將需要的細(xì)胞量接種于合適的培養(yǎng)皿中；

    5、 細(xì)胞感染，通過(guò)接種的細(xì)胞量及預(yù)實(shí)驗(yàn)得來(lái)的MOI來(lái)計(jì)算添加的病毒體積；

6、撤病毒，第二天，一般不超過(guò)24h換液；

    7、 轉(zhuǎn)染48h后選擇對(duì)應(yīng)的抗性藥物進(jìn)行篩選；

8、篩選結(jié)束后進(jìn)行單克隆化，選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)。