蛋白提取是分子生物學(xué)和生物化學(xué)研究中的基礎(chǔ)操作，不同定位的蛋白(總蛋白、核蛋白、膜蛋白)因結(jié)構(gòu)和存在部位差異，提取方法有所不同，以下結(jié)合試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程及關(guān)鍵注意事項(xiàng)詳細(xì)說明：
總蛋白提取：總蛋白提取旨在獲取細(xì)胞或組織中所有蛋白，適用于大多數(shù)蛋白定性、定量及后續(xù)電泳、免疫印跡等實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
試劑預(yù)處理：取出試劑盒中的裂解液，按比例加入蛋白酶抑制劑(避免蛋白降解)和磷酸酶抑制劑(如需保留磷酸化蛋白)，冰上預(yù)冷。
樣品處理：細(xì)胞樣品經(jīng) PBS 洗滌 2 次，去除培養(yǎng)基殘留；組織樣品需在液氮中研磨成粉末，避免常溫下蛋白降解。
提取步驟
加樣裂解：向細(xì)胞沉淀或組織粉末中加入預(yù)冷的裂解液(每 10^6 個(gè)細(xì)胞加 100-200μL，每 10mg 組織加 200-300μL)，渦旋振蕩 10-15 秒，冰上靜置 30 分鐘，期間每 10 分鐘渦旋一次，充分裂解細(xì)胞。
離心分離：4℃、12000-15000g 離心 10-15 分鐘，取上清液，即為總蛋白提取液。
關(guān)鍵注意事項(xiàng)
全程保持低溫操作(0-4℃)，抑制蛋白酶活性。
裂解液需與樣品充分混合，避免局部濃度過高影響裂解效果。
離心后避免觸碰沉淀(含細(xì)胞碎片、核酸等雜質(zhì))，確保上清純度。
核蛋白提取：核蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)，提取需先分離細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，再裂解核膜釋放核蛋白，核心是避免細(xì)胞質(zhì)蛋白污染。
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
試劑預(yù)處理：核蛋白試劑盒通常含細(xì)胞質(zhì)裂解液(低滲緩沖液)和核裂解液，均需加入蛋白酶 / 磷酸酶抑制劑，冰上預(yù)冷。
樣品處理：細(xì)胞經(jīng) PBS 洗滌后，離心收集沉淀，避免反復(fù)吹打損傷細(xì)胞核。
提取步驟
細(xì)胞質(zhì)分離：向細(xì)胞沉淀中加入預(yù)冷的細(xì)胞質(zhì)裂解液，冰上孵育 10-15 分鐘，期間輕輕彈擊管壁數(shù)次，使細(xì)胞膜破裂。4℃、5000g 離心 5 分鐘，收集上清液(細(xì)胞質(zhì)蛋白)，保留沉淀(細(xì)胞核)。
細(xì)胞核洗滌：向細(xì)胞核沉淀中加入少量細(xì)胞質(zhì)裂解液，輕輕吹打洗滌，離心后棄上清，去除殘留的細(xì)胞質(zhì)蛋白。
核蛋白裂解：向洗滌后的細(xì)胞核沉淀中加入核裂解液，冰上孵育 20-30 分鐘，期間頻繁渦旋振蕩，促進(jìn)核膜破裂。4℃、12000g 離心 10 分鐘，取上清液，即為核蛋白提取液。
關(guān)鍵注意事項(xiàng)
細(xì)胞質(zhì)裂解液孵育時(shí)間需嚴(yán)格控制，避免過度裂解導(dǎo)致細(xì)胞核破裂，引發(fā)細(xì)胞質(zhì)蛋白污染。
細(xì)胞核洗滌步驟不可省略，可根據(jù)污染情況重復(fù) 1-2 次。
核裂解液黏度較高，離心后需快速吸取上清，避免沉淀復(fù)溶。
膜蛋白提取：膜蛋白鑲嵌或附著于生物膜上，含大量疏水結(jié)構(gòu)域，常規(guī)裂解液難以溶解，需借助去垢劑(如 Triton X-100、SDS 等)破壞膜結(jié)構(gòu)。
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
試劑預(yù)處理：膜蛋白試劑盒的裂解液含特定比例的去垢劑(兼顧溶解膜蛋白與保持蛋白活性)，加入抑制劑后冰上預(yù)冷。
樣品處理：細(xì)胞或組織樣品需充分破碎(如超聲破碎儀處理細(xì)胞，組織研磨時(shí)加入石英砂)，暴露細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。
提取步驟
加樣裂解：向破碎后的樣品中加入膜蛋白裂解液，冰上孵育 40-60 分鐘，期間每 15 分鐘渦旋一次，使去垢劑充分作用于膜結(jié)構(gòu)。
離心純化：4℃、10000g 離心 10 分鐘，去除未破碎的組織或細(xì)胞碎片；取上清液再次 4℃、15000g 離心 20 分鐘，進(jìn)一步去除雜質(zhì)，最終上清即為膜蛋白提取液。
關(guān)鍵注意事項(xiàng)
去垢劑濃度需嚴(yán)格遵循試劑盒說明，過高可能導(dǎo)致蛋白變性，過低則無法有效溶解膜蛋白。
樣品破碎程度直接影響提取效率，需根據(jù)樣品類型調(diào)整破碎參數(shù)(如超聲功率、研磨時(shí)間)。
膜蛋白提取后需盡快進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，避免去垢劑失效導(dǎo)致蛋白沉淀。
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