細胞核心功能(細胞周期/增殖/活性/缺氧檢測/活性氧/耗氧率檢測)技術(shù)解析

　　在細胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域的研究中，細胞功能檢測是揭示細胞生理狀態(tài)、病理機制及藥物作用效果的核心手段。細胞周期、增殖、活性、缺氧狀態(tài)、活性氧水平及耗氧率等指標，從不同維度反映了細胞的代謝活性、生長狀態(tài)及應(yīng)激反應(yīng)。本文將系統(tǒng)梳理這六種關(guān)鍵檢測技術(shù)的原理、操作要點及應(yīng)用場景，為科研工作者提供全面的技術(shù)參考。?
 

　　一、細胞周期檢測?
 

　　細胞周期是細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，包括 G1 期、S 期、G2 期和 M 期，其進程異常與腫瘤發(fā)生、細胞分化障礙等疾病密切相關(guān)。?
 

　　(一)檢測原理?
 

　　常用碘化丙啶(PI)染色法，PI 可嵌入 DNA 雙鏈中，其熒光強度與 DNA 含量成正比。通過流式細胞儀分析熒光信號，可將處于不同周期時相的細胞區(qū)分開：G1 期細胞含二倍體 DNA，熒光強度呈單峰；S 期細胞處于 DNA 合成階段，熒光強度介于 G1 期和 G2/M 期之間；G2/M 期細胞含四倍體 DNA，熒光強度為 G1 期的兩倍。?
 

　　(二)操作要點?
 

　　樣品制備：收集對數(shù)期細胞，用 PBS 洗滌 2 次，加入 70% 冰乙醇固定，4℃孵育過夜。?
 

　　染色處理：離心去除固定液，PBS 洗滌后，加入 PI 染色液(含 RNase A，避免 RNA 干擾)，室溫避光孵育 30 分鐘。?
 

　　檢測分析：通過流式細胞儀檢測，采用 ModFit 軟件分析各周期時相細胞的比例。?
 

　　(三)應(yīng)用場景?
 

　　主要用于研究細胞增殖調(diào)控機制、腫瘤細胞周期阻滯藥物的篩選，以及細胞分化過程中周期進程的變化。?
 

　　二、細胞增殖檢測?
 

　　細胞增殖檢測用于評估細胞的生長能力，是判斷細胞活力、藥物細胞毒性及生長因子作用效果的重要指標。?
 

　　(一)常用方法及原理?
 

　　CCK-8 法：CCK-8 試劑中的 WST-8 在細胞內(nèi)脫氫酶作用下生成橙色甲臜染料，染料產(chǎn)量與活細胞數(shù)量成正比，通過酶標儀檢測 450nm 處吸光度值，反映細胞增殖水平。?
 

　　EdU 摻入法：EdU 是胸腺嘧啶類似物，可在 S 期摻入新合成的 DNA 中，通過熒光標記的 EdU 抗體檢測熒光信號，直接反映處于增殖期的細胞比例。?
 

　　(二)操作要點?
 

　　CCK-8 法：將細胞接種于 96 孔板，培養(yǎng)至設(shè)定時間點，加入 CCK-8 試劑，繼續(xù)孵育 1-4 小時，檢測吸光度值。需設(shè)置空白對照組，排除試劑本身的吸光干擾。?
 

　　EdU 摻入法：細胞培養(yǎng)時加入 EdU 工作液，孵育 2-24 小時(根據(jù)細胞周期調(diào)整)，固定細胞后進行通透處理，加入熒光標記抗體孵育，熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀定量。?
 

　　(三)應(yīng)用場景?
 

　　廣泛應(yīng)用于藥物篩選(評估藥物對細胞增殖的抑制或促進作用)、細胞毒性檢測、干細胞增殖能力評估等領(lǐng)域。?
 

　　三、細胞活性檢測?
 

　　細胞活性檢測旨在判斷細胞的存活狀態(tài)，區(qū)分活細胞與死細胞，常用于評估實驗處理對細胞的損傷程度。?
 

　　(一)核心方法及原理?
 

　　臺盼藍染色法：臺盼藍是細胞活性染料，活細胞細胞膜完整，染料無法進入；死細胞細胞膜破裂，染料進入后使細胞呈藍色，通過顯微鏡計數(shù)活細胞與死細胞比例。?
 

　　鈣黃綠素 - AM / 碘化丙啶(Calcein-AM/PI)雙染色法：Calcein-AM 可被活細胞內(nèi)的酯酶水解生成綠色熒光物質(zhì)，PI 僅能進入死細胞染色 DNA 呈紅色，通過熒光顯微鏡或流式細胞儀同時區(qū)分活細胞和死細胞。?
 

　　(二)操作要點?
 

　　臺盼藍染色法：取細胞懸液與臺盼藍染液按比例混合，室溫靜置 5 分鐘，顯微鏡下計數(shù) 200 個以上細胞，計算活細胞率。?
 

　　雙染色法：細胞接種于培養(yǎng)皿或 96 孔板，加入染色液孵育 15-30 分鐘，避光條件下觀察熒光信號，綠色熒光為活細胞，紅色熒光為死細胞。?
 

　　(三)應(yīng)用場景?
 

　　適用于細胞培養(yǎng)過程中的活力監(jiān)測、藥物或毒素對細胞的損傷評估、細胞分離純化后的活性檢測等。?
 

　　四、細胞缺氧檢測?
 

　　細胞缺氧是多種生理和病理過程中的重要微環(huán)境特征，如腫瘤組織、缺血性疾病病灶等，缺氧檢測可精準反映細胞所處的氧環(huán)境狀態(tài)。?
 

　　(一)檢測原理?
 

　　采用缺氧特異性探針(如 pimonidazole hydrochloride)，該探針在缺氧條件下(氧分壓 < 10mmHg)可被細胞內(nèi)的還原酶還原，生成能與細胞內(nèi)蛋白結(jié)合的產(chǎn)物，通過免疫熒光或免疫組織化學(xué)方法檢測結(jié)合產(chǎn)物，即可標記缺氧細胞。?
 

　　(二)操作要點?
 

　　細胞水平檢測：將缺氧探針加入細胞培養(yǎng)液，在設(shè)定的缺氧條件下培養(yǎng) 2-4 小時，固定細胞后進行通透處理，加入熒光標記的特異性抗體孵育，熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀定量。?
 

　　組織水平檢測：將探針通過尾靜脈注射入動物體內(nèi)，一段時間后取目標組織，制作石蠟切片，通過免疫組化染色檢測缺氧區(qū)域。?
 

　　(三)應(yīng)用場景?
 

　　主要用于腫瘤微環(huán)境研究、缺血性心臟病及腦卒中的病理機制探討，以及缺氧靶向藥物的研發(fā)與效果評估。?
 

　　五、活性氧檢測?
 

　　活性氧(ROS)是細胞代謝過程中產(chǎn)生的含氧活性物質(zhì)，過量 ROS 會導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，與衰老、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)。?
 

　　(一)檢測原理?
 

　　利用 ROS 特異性熒光探針(如 DCFH-DA、DHE)，探針進入細胞后，被 ROS 氧化生成具有熒光活性的物質(zhì)，熒光強度與 ROS 水平正相關(guān)。DCFH-DA 可檢測總 ROS，DHE 主要檢測超氧陰離子。?
 

　　(二)操作要點?
 

　　細胞接種于培養(yǎng)板，培養(yǎng)至對數(shù)期，加入熒光探針工作液，37℃孵育 20-30 分鐘。?
 

　　用 PBS 洗滌細胞 3 次，去除未進入細胞的游離探針，加入新鮮培養(yǎng)液，通過熒光顯微鏡觀察熒光強度，或用酶標儀 / 流式細胞儀定量檢測。?
 

　　(三)應(yīng)用場景?
 

　　適用于氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的機制研究、抗氧化藥物的篩選與效果評估、環(huán)境毒素對細胞的氧化損傷檢測等。?
 

　　六、耗氧率檢測?
 

　　耗氧率是反映細胞線粒體呼吸功能的核心指標，直接體現(xiàn)細胞的能量代謝水平，對研究線粒體功能障礙相關(guān)疾病具有重要意義。?
 

　　(一)檢測原理?
 

　　采用 Seahorse XF 細胞能量代謝分析儀，該設(shè)備通過檢測細胞培養(yǎng)液中氧氣濃度的實時變化，計算細胞的耗氧率。儀器配備專用培養(yǎng)板，可在不干擾細胞培養(yǎng)的情況下進行動態(tài)監(jiān)測。?
 

　　(二)操作要點?
 

　　細胞接種于 Seahorse 專用培養(yǎng)板，培養(yǎng)至細胞融合度達 70%-80%，更換為無血清無碳酸氫鹽的檢測培養(yǎng)液，37℃無 CO?環(huán)境下平衡 1 小時。?
 

　　設(shè)定檢測程序，加入線粒體呼吸鏈抑制劑(如寡霉素、 FCCP、抗霉素 A 等)，通過分析抑制劑作用前后的耗氧率變化，區(qū)分基礎(chǔ)耗氧率、ATP 耦合耗氧率及最大耗氧率。?
 

　　(三)應(yīng)用場景?
 

　　常用于線粒體功能評估、代謝相關(guān)疾病(如糖尿病、肥胖癥)的機制研究、藥物對細胞代謝的調(diào)控作用分析等。