分子膠（Molecular Glue）是一類靶向蛋白降解（TPD）的小分子化合物，通過促進(jìn)E3連接酶與新底物間的相互作用，觸發(fā)泛素-蛋白酶系統(tǒng)，精準(zhǔn)誘導(dǎo)靶蛋白降解。與蛋白降解靶向嵌合體（PROTAC）技術(shù)相比，分子膠具有分子量小、成藥性高、脫靶效應(yīng)低等優(yōu)勢(shì)[1]。

目前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的來那度胺和泊馬度胺等分子膠藥物，在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等領(lǐng)域療效顯著，惠及數(shù)百萬患者并創(chuàng)造數(shù)百億美元收入[2]。然而，分子膠研發(fā)仍面臨挑戰(zhàn)，如發(fā)現(xiàn)過程缺乏系統(tǒng)性篩選方法，靶點(diǎn)確認(rèn)和機(jī)制研究耗資巨大，限制了其進(jìn)一步發(fā)展。

圖1. 分子膠作用原理[1]

隨著高通量篩選技術(shù)的不斷發(fā)展，分子膠有望在生物驗(yàn)證、靶點(diǎn)確認(rèn)和機(jī)制研究領(lǐng)域取得更多突破性進(jìn)展。HTRF/Lance和Alpha技術(shù)具有均相免洗、操作簡單高效、信號(hào)穩(wěn)定、靈敏度高、適用于高通量檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛用于潛在分子膠靶標(biāo)和效應(yīng)蛋白之間親和力的驗(yàn)證。

Lance及Alpha技術(shù)在分子內(nèi)二價(jià)膠親和力測(cè)定中的應(yīng)用

BRD4在多種癌細(xì)胞中過表達(dá), 在癌細(xì)胞的遷移、代謝和惡性發(fā)展中發(fā)揮重要作用。BRD4作為溴結(jié)構(gòu)域和末端外結(jié)構(gòu)域 (BET) 家族的成員，其特征在于具有兩個(gè)串聯(lián)溴結(jié)構(gòu)域（BD1、BD2）。最近的一項(xiàng)描述了一種分子內(nèi)二價(jià)膠的降解劑IBG1。IBG1能夠結(jié)合BRD4的兩個(gè)串聯(lián)溴結(jié)構(gòu)域，并將BRD4結(jié)合到DCAF16（Cullin RING E3 泛素連接酶）上，從而誘導(dǎo)BRD4的降解。

為了在生化水平驗(yàn)證IBG1與BRD4和DCAF16的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，Oliver等[3]使用Lance Anti-His-Eu、His-BRD4及Cy5標(biāo)記的DCAF16測(cè)定三元復(fù)合物的形成，他們發(fā)現(xiàn)IBG1能增強(qiáng)BRD4Tandem*和DCAF16之間的相互作用，而非通過單一BD1或BD2結(jié)構(gòu)域（圖2b,c）。

圖2. IBG1增強(qiáng)BRD4 Tandem結(jié)構(gòu)域和DCAF16之間的相互作用[3]

* Tandem: BRD4包含兩個(gè)溴結(jié)構(gòu)域（BD1 和 BD2）的構(gòu)建體

*JQ1: BET 家族溴結(jié)構(gòu)域抑制劑

隨后，他們使用biotinylated-JQ1*, SA-Donor beads, His-BRD4, Nickel Chelate Acceptor beads，構(gòu)建AlphaLISA displacement實(shí)驗(yàn)（圖2e），驗(yàn)證IBG1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合BRD4的能力。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三元復(fù)合物BRD4Tandem: IBG1: DCAF16的親和力顯著強(qiáng)于BRD4BD1: IBG1: DCAF16，進(jìn)一步證實(shí)了兩個(gè)溴結(jié)構(gòu)域?qū)τ趶?fù)合物形成都是必需的?？傊?，Lance及Alpha的實(shí)驗(yàn)確立了IBG1能夠增強(qiáng)BRD4和DCAF16的親和力，并且需要BRD4兩個(gè)溴結(jié)構(gòu)域的存在。

HTRF技術(shù)在分子膠親和力測(cè)定中的應(yīng)用

SMAD4是TGF-β通路的核心介質(zhì)，在TGF-β的刺激下，SMAD4與SMAD3等形成復(fù)合物，將信號(hào)從細(xì)胞外傳遞至細(xì)胞核，調(diào)控基因表達(dá)。SMAD4R361H突變是多種腫瘤中的常見突變，會(huì)損害SMAD4和SMAD3之間的相互作用，從而阻斷TGF-β誘導(dǎo)的抗增殖信號(hào)傳導(dǎo)。

為了檢測(cè)Ro-31-8220和Go-6983對(duì)His-SMAD4/SMAD4 R361H和Flag-SMAD3的相互作用的影響，Cong Tang等[4]使用HTRF Anti-FLAG-Tb Donor及Anti-His-d2 Acceptor構(gòu)建了靈敏且可擴(kuò)展的高通量篩選平臺(tái)。Ro-31-8220和Go-6983被鑒定為分子膠，可誘導(dǎo)SMAD4 R361H/SMAD3的相互作用。

圖3. Ro-31-8220和Go-6983被鑒定為分子膠誘導(dǎo)SMAD4 R361H/SMAD3的相互作用[4]

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