主要雜質(zhì)包括宿主細胞核酸、宿主細胞蛋白（包括令人生畏的染色質(zhì)形式）、衣殼聚集體、衣殼-DNA 復合物、以及具有不同核酸填充物不同組合的衣殼（從部分完整衣殼（partial capsid）裝載到包含進宿主細胞 DNA ）。

如果說空/實衣殼分離前的步驟（優(yōu)化宿主細胞中的AAV生產(chǎn)，裂解，色譜前步驟，如固相萃取 – 檢查Kryptonase，絮凝，酸化，疏水交換色譜，超濾/滲濾和AAV捕獲 - 如CIMmultus SO3陽離子交換或親和層析）主要是針對宿主細胞DNA和不同形狀和形式的宿主蛋白，那么實衣殼分離就是接下來的第二個任務， 也就是拋光步驟。

需要補充的一點是，沒有適用于所有生產(chǎn)工藝的標準流程。不同的AAV血清型，宿主細胞的選擇，裂解方案以及下游的不同步驟會產(chǎn)生獨特的樣品，必須根據(jù)樣品定制實衣殼分離方案。

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色譜分離方法工具箱

為此，我們開發(fā)了一個色譜分離方法工具箱，可用于尋求最佳純度和回收率。下面的研究結果是在分析型色譜柱（CIMac系列）上進行的，其中注入了CEX-SO3純化的樣品。通過這些結果也可用于了解生產(chǎn)規(guī)模上使用 CIMmultus的情況（盡管考慮到分辨率略有下降 - 分析柱已根據(jù)分辨率進行了優(yōu)化）。

CIMac™ AAV Empty/Full（等同：CIMmultus QA）是一種基于季胺（QA）的色譜柱（一種強陰離子交換柱），其中空衣殼和實衣殼的分離基于衣殼群體之間的電荷差異。AAV的洗脫是在堿性緩沖液中使用NaCl梯度實現(xiàn)的。

CIMac PrimaS™ Empty/Full（等同：CIMmultus PrimaS）采用離子交換-氫鍵多模式配基，可在pH梯度模式下分離空衣殼和實衣殼。這與季胺（QA）不同，QA中（假設所有其他條件保持不變）增加pH值會導致衣殼的強烈結合，這會導致洗脫時向更高電導率的轉變。在較高的pH值下上樣將增加分離效果。

CIMac™ PrimaT-Beta（等同：CIMmultus PrimaT）是一種用于空衣殼和實衣殼完全分離的多模式色譜柱，其功能等同于弱陰離子交換柱，此外該色譜柱還通過氫鍵和金屬離子與樣品相互作用。它可以使用MgCl₂和NaCl洗脫梯度的組合來分離空衣殼和實衣殼的不同亞群。

上面介紹的工作基于 Zvanut 等人的科學海報（2022），BIA Separations。

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方法

樣品是使用CEX - CIMmultusTM SO3部分純化的AAV2 / 8。PATfix系統(tǒng)（BIA Separations）用于色譜分離：

檢測器設置：

• 電導率和pH值

• 吸光度（260 nm，280 nm），50mm UV流通池

• 熒光（激發(fā)/發(fā)射：280/348 nm）

• 光散射（角度：90°）

使用的色譜柱：

CIMac™ AAV Empty/Full 0.1 mL 分析柱（1.3 μm 通道）;貨號：110.8503-1.3

CIMac PrimaS™ Empty/Full 0.1 mL 分析柱（2 μm 通道）;貨號：BIA-110.8504-2

CIMac™ PrimaT 0.1 mL Beta 分析柱（2 μm 通道）; 貨號：BETA 0009

流動相和色譜方法

流速：1 mL/min

使用一系列結合和洗脫緩沖液（緩沖液A 30 CV、緩沖液B 30 CV、緩沖液A 30 CV）平衡色譜柱。進樣后和梯度開始之前，允許20 CV的結合緩沖液。

進樣前先運行3個用結合緩沖液代替的空白樣品。如果電導率和pH值尚未穩(wěn)定，可以運行更多。

為了減少樣品殘留，注入在定量限度內(nèi)仍能產(chǎn)生結果的最小量（可能需要進行測試）。

CIMac™ AAV Empty/Full

• 緩沖液A：20 mM BTP + 2 mM 氯化鎂 + 1 % 山梨糖醇 + 0.1 % poloxamer 188，pH 9.0

• 緩沖液B：20 mM BTP + 2 mM 氯化鎂 + 200 mM 氯化鈉 + 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer 188，pH 9.0

NaCl梯度：從100%緩沖液A到50%緩沖液B的5分鐘梯度。

CIMac PrimaS™ (AAV)

• 緩沖液A：10 mM BTP + 10 mM TRIS + 2 mM 氯化鎂 + 1 % 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer 188，pH 8.0

• 緩沖液B：10 mm BTP + 10 mM TRIS + 2 mM 氯化鎂 + 1 % 山梨糖醇 + 0.1 % poloxamer 188，pH 9.5*

*添加NaCl以實現(xiàn)緩沖液A和緩沖液B的相同電導率。

pH 梯度：從 100% 緩沖液 A 到 100% 緩沖液 B 的 2.5 分鐘梯度。

CIMac™ PrimaT-Beta

• 緩沖液A：25 mM HEPES、1% 蔗糖、0.1 % poloxamer， pH 7.0

• 緩沖液B：50 mM Tris、13.6 mM 硼 鹽、1 % 蔗糖、0.1 % poloxamer， pH 9.0

• 緩沖液C：50 mM Tris、9.6 mM 硼 鹽、50 mM 氯化鎂 2、1% 蔗糖、0.1 % poloxamer， pH 9.0

• 緩沖液D：50 mM Tris、12 mM 硼 鹽、2 M 氯化鈉、1% 蔗糖、0.1 % poloxamer， pH 9.0

梯度：從100%緩沖液B到100%緩沖液C的2.5分鐘梯度，然后從100%緩沖液B到100%緩沖液D的2.0分鐘梯度。

根據(jù)基于UV信號的標準方程計算分辨率：R = 2 t_F − t_E / w_F + w_E ，其中 t_F 和 t_E 是保留時間，w_F 和 w_E 是AAV實衣殼和空衣殼基線處的峰寬度。根據(jù)熒光計算空衣殼和實AAV衣殼的百分比（%E和%F）。將光散射添加到色譜圖中進行比較。

結果和討論

比較所有三種色譜柱的結果，估算出的AAV空殼率和實殼率是近似的，即52%空殼率和48%實殼率。在這種情況下，使用熒光信號會產(chǎn)生比UV更接近實際狀態(tài)的結果。主要是因為與紫外線相比，熒光信號下AAV中的DNA裝載對讀數(shù)的影響較小，而核酸對紫外信號的吸收相當顯著，因此會高估了實衣殼的比例。熒光信號可實現(xiàn)更微量級別的檢測和定量。

然而事情并不這么簡單。色譜分離的不同目的意味著我們對色譜分離也有不同的要求。對于分析目的而言，良好的分辨率，但同樣重要的是測量兩種衣殼的色譜峰面積的難易程度。這里基于QA色譜柱的結果顯示，當使用梯度方法時，很少能提供基線分離，但是空衣殼聚集在一個峰，實衣殼聚集到另一個峰，使得進行面積測量相對容易。如果始終使用相同的標準進行定量（空衣殼峰在兩峰之間的最低點結束），則誤差是可重現(xiàn)的，因此可以保證可重現(xiàn)的并且可靠的分析。
 

 PrimaS色譜柱提供輪廓相似的色譜圖，其中兩個峰似乎相距更遠（盡管稀釋倍數(shù)更高），但分辨率會降低。這確實意味著對于分析目的而言QA色譜柱可能更合適，但對于制備目的PrimaS更具有優(yōu)勢。補充一點，這些結論是基于已有案例，可能并非在所有情況下都是正確的——兩種色譜柱都可以用于分析和制備測試。

 另一方面，PrimaT色譜柱提供了非常不同的特異性，保證了空衣殼和實衣殼的不同亞群分離。根據(jù)已有的使用經(jīng)驗，這可能是需要的或最好避免的。對于制備目的，需要收集和分析洗脫物質(zhì)的餾分，并考慮隨后應如何富集這些餾分以獲得最佳純度。對于分析目的，PrimaT色譜柱確實可以讓我們更深入地了解空衣殼和實衣殼的組成，但在空殼和實殼被認為是同質(zhì)的情況下，可能更難進行一般性測量。我們預計未來將需要對亞種群結構有更多的了解，因此PrimaT色譜柱提供了一個可以在此類場景應用的工具。PrimaT色譜柱也可以測試用于制備目的。

 一直以來，BIA Separations是質(zhì)粒DNA、AAV、mRNA高效率純化的。不僅提供整體柱及平臺方法，還提供定制的純化服務，以滿足質(zhì)粒DNA、AAV、mRNA規(guī)模化生產(chǎn)的純化需求。