兩步質(zhì)粒DNA純化分離rRNA~加速神器 CIM DEAE整體柱
兩步質(zhì)粒DNA純化分離rRNA~加速神器 CIM DEAE整體柱
面對(duì)如此眾多品種的質(zhì)粒，有沒(méi)有一種質(zhì)粒 DNA 純化平臺(tái)，能夠適用多種質(zhì)粒的、可放大的，滿足基因治療、細(xì)胞治療和疫苗的高純度和同質(zhì)性的標(biāo)準(zhǔn)要求，并且還需要有效，穩(wěn)健和可擴(kuò)展的下游過(guò)程呢?
接下來(lái)為大家隆重介紹 BIA Separations 提供的，基于對(duì)流相互作用介質(zhì)（CIM）層析整體柱的兩步質(zhì)粒 DNA（pDNA）純化平臺(tái)！
該方法除了具有以上全部?jī)?yōu)點(diǎn)，并且可以明顯降低純化時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，使其成為 GMP 環(huán)境下的大規(guī)模 pDNA 純化的選擇。
該方法專為純化大分子和納米顆粒的整體柱而設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)快速操作，高流量，同時(shí)提供動(dòng)態(tài)結(jié)合能力和分辨率。
首先要為整個(gè)過(guò)程中的核心——兩步層析步驟，準(zhǔn)備細(xì)菌培養(yǎng)液
1. 大腸桿菌收獲、裂解－堿裂解：
這是快速高效純化質(zhì)粒 DNA 亞型的基礎(chǔ)。
操作建議：
先收集菌體； 然后采用堿性裂解法制備原料；
再將細(xì)菌細(xì)胞（通常是細(xì)胞生物質(zhì)或細(xì)胞沉淀）懸浮在 50 mMTris-HCl，10 mM EDTA，pH8.0 中；
通過(guò)加入等體積的 0.1-0.4M NaOH，1%SDS 進(jìn)行裂解。
2. 裂解液濃縮：
氯化鈣沉淀后澄清，除去了大量的主要樣品雜質(zhì)
??????? 裂解后，懸浮液變粘稠，通過(guò)加入與懸浮緩沖液等體積的，4-8℃ 冷卻的 3M CH 3 COOK（pH 5.5）沉淀細(xì)胞碎片和 SDS 復(fù)合物。
??????? 在溫和混合下，緩慢加入 CaCl2 并孵育 15 分鐘。
TIPS:
1. 氯化鈣用作沉淀劑，以去除 RNA、基因組 DNA 和其他雜質(zhì);
2. 較高濃度的雜質(zhì)需要 CaCl2 濃度高達(dá) 1M;
3. 考慮測(cè)試多種濃度并評(píng)估產(chǎn)品中雜質(zhì)的有效去除和未受影響的 pDNA 產(chǎn)量;
4. 加入速度應(yīng)該很慢，以防止局部溫度上升;
5. 孵育后，進(jìn)行一系列澄清步驟，從離心或粗過(guò)濾開(kāi)始，例如 80μm 深度過(guò)濾，并以 1-5μm 過(guò)濾結(jié)束。
（低溫有利于沉淀，混合過(guò)程應(yīng)該溫和操作，以防止 DNA 降解。）
前面 blabla 說(shuō)了那么多，然而純化才是本工藝的精華所在。
BIA Separations 的二步純化工藝的穩(wěn)健性、連貫性、時(shí)效性，均堪稱教科書(shū)式的經(jīng)典。
一步純化的柱子，通過(guò)弱陰離子交換，濃縮 pDNA 并去除大部分 HCP、mRNA 和基因組 DNA；
第二步利用疏水相互作用色譜（HIC）的拋光步驟，進(jìn)一步從超螺旋（SC）治療級(jí) pDNA 中除去開(kāi)環(huán)（OC）和線性 pDNA 亞型。
兩步純化的作用功能明確、互相合作，大大節(jié)省操作步驟和時(shí)間。
??????? AEX 色譜柱（CIMmultus™DEAE）濃縮 pDNA，并去除大部分 HCP、mRNA 和基因組 DNA。
??????? 在弱陰離子交換柱上捕獲質(zhì)粒 DNA，其中除去剩余的 RNA 和蛋白質(zhì)，樣品結(jié)合需要低電導(dǎo)率，通過(guò)稀釋實(shí)現(xiàn)。
??????? 隨著增加 NaCl 的梯度洗脫，首先洗脫 RNA，然后洗脫質(zhì)粒 DNA。
層析條件
Monolithic column: | CIMmultus™ DEAE(2 µm)*1 |
Mbile phase: | Equilibration buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2 |
Washing buffer A2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.6 M NaCl, pH 7.2 | |
Elution buffer A3: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, pH 7.2 | |
Working flow rates: | 0.5 – 5 column volume (CV) /min (具體取決于樣品特性，使用的層析設(shè)備和色譜柱尺寸) |
*1 選擇色譜柱體積，取決于需要處理的樣品量。
層析方法
1. 用去離子水稀釋細(xì)菌裂解物至電導(dǎo)率為 35-40mS / cm。稀釋取決于樣品制備過(guò)程中添加的 CaCl2 濃度。
2. 將稀釋的樣品用 0.45μm 過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。
3. 將 20CV 的緩沖液 A1 平衡 DEAE 柱。
4. 將澄清的稀釋細(xì)菌裂解液進(jìn)行上樣。
5. 用 20 CV 的緩沖液 A1 對(duì)色譜柱進(jìn)行流洗。
6. 用 20 CV 的緩沖液 A2 對(duì)色譜柱進(jìn)行流洗。
7. 用 20 CV 的緩沖液 A3（以半工作流速）洗脫并收集 pDNA。
圖 1：AEX CIMmultus™DEAE（2μm）柱上的質(zhì)粒 DNA 洗脫曲線
??????? 在高配體密度丁基修飾的（CIMmultus TM C4 HLD）整體柱上，利用疏水相互作用色譜柱（HIC）的拋光步驟，進(jìn)一步從 超螺旋（SC）治療級(jí) pDNA 中除去開(kāi)環(huán)（OC）和線性 pDNA 亞型。
??????? ??????? 為了富集質(zhì)粒 DNA 的超螺旋亞型，將 DEAE 洗脫液上樣到高配體密度丁基柱（C4 HLD）上。
??????? ??????? 該步驟進(jìn)一步去除了雜質(zhì)。
層析條件
Monolithic column: | CIMmultus™ C4 HLD (2 µm)*2 |
Mbile phase: | Equilibration buffer B0: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 3 M (NH4)2SO4, pH 7.2 |
Washing buffer B1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1.7 M (NH4)2SO4, pH 7.2 | |
Adjustment buffer: 4 M (NH4)2SO4 | |
Elution buffer B2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.4 M (NH4)2SO4 , pH 7.2 | |
Regeneration buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2 | |
Working flow rates: | 0.5 – 5 CV/min (具體取決于樣品特性、使用的層析設(shè)備和色譜柱尺寸) |
*2 選擇色譜柱體積，取決于需要處理的樣品量。
層析方法
1. 調(diào)節(jié)來(lái)自 DEAE 柱的含 pDNA 洗脫液，每 1 體積（V）洗脫液加入 3 體積（V）的 4M(NH4)2SO4。
2. 用 20CV 的緩沖液 B0 來(lái)平衡 C4 HLD 柱。
3. 將 DEAE 柱洗脫的 pDNA 組份上樣。
4. 用 20 CV 的緩沖液 B1 流洗色譜柱。
5. 用緩沖液 B2（以半工作流速）洗脫并收集 pDNA。
6. 用 30 CV 的緩沖液 A1 再生色譜柱。
7. 加樣 3 次后，對(duì)柱子進(jìn)行清洗。
圖 2：在 HIC CIMmultus TM C4 HLD（2μm）柱上分離超螺旋質(zhì)粒 DNA
· 從 C4 HLD 柱洗脫的超螺旋 pDNA 組份含有硫酸銨，必須在生物應(yīng)用質(zhì)粒之前將其除去。
· 緩沖液交換可通過(guò)透析濾過(guò)或體積排除色譜等方法進(jìn)行。
· 配置和填充可能需要額外的處理。
二步法層析過(guò)程分析：
??????? 質(zhì)粒 DNA 制造成功的關(guān)鍵是實(shí)時(shí)過(guò)程控制方法，確保終產(chǎn)品中高百分比的超螺旋 pDNA。
?????????? CIMac™pDNA 分析柱可用于監(jiān)測(cè)降解產(chǎn)物（開(kāi)環(huán)和線性 pDNA），去除雜質(zhì)（RNA），并確保每個(gè)生產(chǎn)步驟都能產(chǎn)生預(yù)期的超螺旋 pDNA 量。
??????? ???????CIMac™pDNA 分析柱還用于超螺旋質(zhì)粒 DNA 含量的質(zhì)量控制。
圖 3：使用 CIMac™pDNA-0.3 分析柱的質(zhì)粒 DNA 亞型含量的質(zhì)量控制
結(jié)果和結(jié)論：
??????? ????? 通過(guò)優(yōu)化裂解、沉淀和兩種色譜步驟相結(jié)合，可生產(chǎn)滿足所有監(jiān)管要求的純 pDNA。
??????? ??????? 可以完成去除 99% 以上的主要雜質(zhì)（RNA，基因組 DNA，宿主細(xì)胞蛋白，內(nèi)毒素和開(kāi)環(huán) pDNA）。
??????? ??????? 此外，快速（大腸桿菌的 pDNA 提取和純化可在幾小時(shí)內(nèi)完成），可重復(fù)的過(guò)程可降低運(yùn)營(yíng)成本并提高工廠生產(chǎn)率。
??????? ??????? *的整體特性有助于該過(guò)程的直接可擴(kuò)展性，涵蓋從小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室到大規(guī)模工業(yè)純化 pDNA 的生產(chǎn)水平。
Table 1: Process results.
Process yield | > 80 % |
A260/280 | 1.92 |
Homogeneity (SC pDNA) | > 97 % |
HCD – removed | > 99.5 % |
HCP - removed | > 99 % |
Endotoxin | < 2 EU/mg pDNA |
RNA - removed | > 99 % |
點(diǎn)評(píng)
目前市面上有不少質(zhì)粒純化工藝方案，但是比較下來(lái)，BIA 二步法純化工藝具有兩大優(yōu)勢(shì)：
??????? 效率明顯提高
只需兩步色譜和高流速的整體柱色譜方案，減少工藝步驟（提高回收率）并加快純化速度，從而顯著提高生產(chǎn)率。
??????? 靈活放大
由于特定的整體柱設(shè)計(jì)，質(zhì)粒 DNA 過(guò)程可以快速擴(kuò)展到更大的單位。
在 1 毫升色譜柱上設(shè)計(jì)的工藝可以輕松轉(zhuǎn)移到試驗(yàn)和生產(chǎn)規(guī)模。
在 8L 色譜柱上單次運(yùn)行可以產(chǎn)生 48 g 藥物級(jí) scDNA。
Table 2: Scale up options.
Column size | pDNA purified per cycle |
1 mL | 6 mg |
8 mL | 48 mg |
80 mL | 480 mg |
800 ml | 4.8 g |
8000 mL | 48 g |
十多年來(lái)，BIA Separations 一直是高效率質(zhì)粒純化的好選擇。它不僅提供整體柱和平臺(tái)模板，還提供定制的純化服務(wù)，以*您的質(zhì)粒 DNA 純化需求。
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