Tunel染色
       Tunel染色即原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)。凋亡細(xì)胞的DNA雙鏈斷裂或一條鏈出現(xiàn)缺口，產(chǎn)生一系列3’-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)作用下，將脫氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3′末端，從而進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測。TUNLE染色是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征。
技術(shù)原理
       晚期凋亡細(xì)胞中染色體DNA雙鏈或單鏈斷裂產(chǎn)生粘性3'-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的催化下，將帶有生物素(Biotin)分子的dUTP，標(biāo)記到DNA的3'-末端，隨后和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈酶親和素Streptavidin(Streptavidin-HRP)結(jié)合，最后通過DAB顯色來顯示凋亡細(xì)胞，從而可以通過普通光學(xué)顯微鏡檢測到凋亡的細(xì)胞，這就是Tunel(TdT-mediateddUTPNick-EndLabeling)法檢測細(xì)胞凋亡的原理。
實(shí)驗(yàn)流程

 
 
關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)步驟
       1.充分脫蠟和水化。脫蠟可以先60oC 20min，再用使用二甲苯兩次5-10min；而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗，這些以便后面的結(jié)合反應(yīng)充分、均勻；
       2.把握好細(xì)胞通透的時間。一般根據(jù)切片的厚薄，選擇蛋白酶k的孵育時間，常用10-30min，幾μm切片用短時間；幾十μm切片用長時間，通過摸索達(dá)到既不脫片，有能夠使后面的酶和抗體進(jìn)入胞內(nèi)。
       3.適當(dāng)延長TUNEL反應(yīng)液的時間。一般是37oC1h，你也可以根據(jù)你的凋亡損傷程度，選擇更長的時間，可長至2h，但要結(jié)合你最終的背景著色。
       4.DAB顯色條件的選擇。一般DAB反應(yīng)10min左右，結(jié)合鏡下控制背景顏色，最長不超過30min；promega公司提供的DAB液（桃紅色），不利于辨認(rèn)棕褐色，我不太喜歡。
       5.PBS的充分清洗。在TUNEL反應(yīng)后和酶標(biāo)反應(yīng)后的清洗應(yīng)十分嚴(yán)格，可增加次數(shù)達(dá)5次，因?yàn)檫@些清洗直接決定最后切片的非特異性著色。
       6.內(nèi)源性POD的封閉也十分關(guān)鍵。對于肝臟、腎臟等血細(xì)胞含量多的組織，我的經(jīng)驗(yàn)是適當(dāng)延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度，可以達(dá)到很好的封閉效果，且不影響最終的特異性染色。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示：
注意事項(xiàng)
       1、洗滌蛋白酶K時，一定要PBS沖洗3次，如果沖洗不凈會嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)；
       2、3%的過氧化氫溶液孵育時間不應(yīng)過長，否則會出現(xiàn)過氧化氫導(dǎo)致的DNA斷裂，產(chǎn)生假陽性；
       3、滴加Tunel檢測液時，可利用防蒸發(fā)膜防止其蒸發(fā)影響樣本的生物素標(biāo)記；配制好的DAB顯色液必須一次性使用完畢，不宜凍存。
常見問題
       無/弱染色？
       烤片溫度過高，推薦56℃-60℃1-2h；
       一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過低，孵育是否時間過短等。
       染色過深？
       染色試濃度過高或孵育時間過長；
       顯色劑濃度過高或孵育時間過長。
       送樣運(yùn)輸要求：
      1、石蠟切片常溫、組織由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋，石蠟與組織要均勻接合，不能有裂痕；蠟塊厚度根據(jù)所需切片的數(shù)量而定，有效厚度至少要超過0.1cm。盡量提供半年內(nèi)的組織蠟塊，超過半年的蠟塊抗原可能丟失，做免疫組化可能出現(xiàn)檢測不到蛋白。
      2、冰凍切片-20℃、固定后細(xì)胞爬片4℃。