- 概要
伏馬毒素是串珠鐮刀菌、輪狀鐮刀菌和多育鐮刀菌等產(chǎn)生的。伏馬毒素B1和B2是自然界存在普遍且毒性qiang的兩種毒素。其主要存在于玉米及玉米制品中，在大米、面條、調(diào)味品、高粱以及啤酒中也有較低濃度的伏馬毒素存在。1993年伏馬毒素被癌癥研究機構(gòu)（IARC）歸類為2B類致癌物。
- 原理
測定的基礎(chǔ)是抗原-抗體反應(yīng)。微孔板上包被有抗抗體。加入伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、酶標(biāo)抗原和抗體后，游離的伏馬毒素與酶標(biāo)抗原競爭結(jié)合抗體，抗體或抗體結(jié)合物與固定在微孔板上的抗抗體再結(jié)合，沒有結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)抗原及抗體被洗去，加入TMB底物顯藍色，加入終止液后顏色由藍變黃，用酶標(biāo)儀在450nm處檢測，吸光值與樣品中伏馬毒素含量成負相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出伏馬毒素的含量。
- 試劑盒的組成
- 包被有抗抗體的96微孔板：1塊（96 孔，12條×8 孔）
- 伏馬毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品：0 ng/mL、1 ng/mL、 4ng/mL、10ng/mL、50ng/mL 1瓶 × 1.0mL
- Fum酶標(biāo)抗原： 1瓶 ×10mL
- Fum抗體： 1瓶 ×10mL
- 10× 濃縮洗滌液： 1瓶 × 50mL
- Fum稀釋緩沖液A： 1瓶 × 50mL
- Fum稀釋緩沖液B： 1瓶 × 50mL
- 顯色底物TMB： 1瓶 × 17mL
- 終止液： 1瓶 × 7mL
- 試劑盒說明書： 1份
- 質(zhì)檢報告： 1份
- 需要的儀器、試劑
1）儀器
- 酶標(biāo)儀450nm（iELisa全自動酶標(biāo)儀或相當(dāng)者）
- 微量移液器：20μL-200μL單道，100μL-1000μL單道, 50μL-300μL八道
- 多功能旋轉(zhuǎn)混合器（或者搖床、高速均質(zhì)器）
- 酶標(biāo)板振蕩器
- 渦旋混合器
- 50mL離心管
- 1.5mL離心管
- 定性濾紙
- 過濾漏斗
- 天平：感量0.01g
- 試劑
- 樣品提取液70%甲醇：取700mL甲醇，加300mL純水，混勻。
- 樣品處理
5.1谷物（玉米、小麥、高粱、大米、大豆）：
- 稱取5.0g粉碎樣品于50mL離心管中，加入25.0mL樣品提取液70%甲醇,置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩10分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì)3分鐘，或搖床上振蕩40分鐘）。
- 將提取液用普通濾紙過濾，吸取50μL濾液置于1.5mL離心管中，加入450μL Fum稀釋緩沖液A，用渦旋混合器混勻。
稀釋倍數(shù)：50
5.2飼料：
- 稱取5.0g粉碎樣品于50mL離心管中，加入25.0mL樣品提取液70%甲醇,置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩10分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì)3分鐘，或搖床上振蕩40分鐘）。
- 將提取液用普通濾紙過濾，(復(fù)雜基質(zhì)樣品建議用0.22μm有機系濾膜過濾后使用)，取20μL濾液置于1.5mL離心管中，加入780uL Fum稀釋緩沖液B，用渦旋混合器混勻。
稀釋倍數(shù)：200
5.3啤酒：
取5mL啤酒超聲5分鐘，取100μL超聲后啤酒樣品于1mL離心管中，加入900μL Fum稀釋緩沖液B，用渦旋混合器混勻。
稀釋倍數(shù)：10
6． 酶聯(lián)免疫分析程序
6.1測定之前注意事項
- 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。
- 使用后迅速將試劑放入2-8℃冷藏。
- 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
- 所有溫育過程應(yīng)避免陽光直射，并按要求用蓋板覆蓋住酶標(biāo)板。
6.2溶液的配制
- 提取液的配制: 根據(jù)實驗所需的量配制70%的甲醇水溶液（水要用純水、或蒸餾水、去離子水）
- 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用純水稀釋10倍后使用。（例如：取10 mL 濃縮液+90 mL純水, 可以用于32孔的檢測）。
6.3測定程序
- 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶標(biāo)板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個平行實驗，記錄下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔袋封好置2-8℃冷藏保存。
- 吸取50μL 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品分別加至相應(yīng)的微孔（雙孔）中，然后各加入50μL Fum酶標(biāo)抗原，再加入50μL Fum抗體，加蓋，在室溫溫育30分鐘（每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必須使用新的吸頭）。
- 倒出孔中的液體，每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液，置于酶標(biāo)板振蕩器上振蕩30秒（或者手工振蕩），重復(fù)操作四次。洗完后用力在吸水紙上拍干。
- 每孔加入150μL顯色底物TMB，室溫避光溫育10分鐘。
- 每孔加入50μL 終止液。
- 置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸光度值（OD值），參比波長630nm。（iELisa全自動酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值）。
7. 結(jié)果判定
1）所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以DI一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B<蘇b>0）再乘以*，即百分吸光度值。
以伏馬毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品濃度值（ppb）為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對應(yīng)每一個樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。
- 樣品的實際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
- 如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一定的比例用70%甲醇進行稀釋。
8. 注意事項
- 室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會導(dǎo)致數(shù)值偏低。
- 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥過久的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板排干后應(yīng)立即進行下一步操作。
- 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對光敏感，避免直接暴露在光線下。
- 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn)液的時候都必需充分混合均勻）。
- 終止液為強酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。
- 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要混合使用不同批次的試劑盒，這樣會引起測定結(jié)果不準(zhǔn)確。
- 試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。
9. 試劑盒的性能指標(biāo)
- 檢測限LOD: 谷物30ppb(μg/kg)，飼料120ppb，
啤酒6ppb（LOD：空白樣品測定值+2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差SD）
- 定量限LOQ: 谷物50ppb，飼料200ppb，啤酒10ppb。
- 定量檢測范圍：谷物50-2500ppb，飼料200-10000ppb，啤酒10-500ppb。
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