1. 概要

嘔吐毒素也稱為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），是由串珠鐮刀菌、輪狀鐮刀菌以及多育鐮刀菌等產(chǎn)生的真菌毒素，大多存在于糧谷、飼料及其制品中。中毒后影響消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐、頭痛、頭暈、腹痛、腹瀉等癥狀。我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：玉米、大麥、小麥及其制品中嘔吐毒素不得超過(guò)1mg/kg，豬、犢牛、泌乳期動(dòng)物配合飼料中嘔吐毒素不得超過(guò)1mg/kg，牛、家禽配合飼料中嘔吐毒素不得超過(guò)5mg/kg。

1. 原理

測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原-抗體反應(yīng)。微孔板上包被有抗抗體。加入嘔吐毒素（DON）標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、酶標(biāo)抗原和抗體后，游離的嘔吐毒素與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，抗體或抗體結(jié)合物與固定在微孔板上的抗抗體再結(jié)合，沒有結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)抗原及抗體被洗去，加入TMB底物顯藍(lán)色，加入終止液后顏色由藍(lán)變黃，用酶標(biāo)儀在450nm處檢測(cè)，吸光值與樣品中嘔吐毒素含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出嘔吐毒素的含量。

1. 試劑盒的組成

1. 包被有抗抗體的96微孔板：1塊（96 孔，12 條×8 孔）

1. DON標(biāo)準(zhǔn)品：0ng/mL 、10ng/mL、

40ng/mL、100ng/mL、250ng/mL 1 瓶 × 1.0mL

1. DON抗體：              1 瓶 × 10mL
2. DON酶標(biāo)抗原：           1 瓶 × 10mL
3. 10× 濃縮洗滌液：         1 瓶 × 50mL
4. DON稀釋緩沖液A：        1 瓶 × 50mL
5. DON稀釋緩沖液B：        1 瓶 × 50mL
6. 顯色底物TMB：           1 瓶 × 17mL
7. 終止液：                 1 瓶 × 7mL
8. 試劑盒說(shuō)明書：           1份
9. 質(zhì)檢報(bào)告：               1份

1. 需要的儀器、試劑

1. 儀器   

1. 酶標(biāo)儀 450nm（iELisa全自動(dòng)酶標(biāo)儀或相當(dāng)者）
2. 微量移液器：20μL-200μL單道，100μL-1000μL單道, 50μL-300μL八道
3. 多功能旋轉(zhuǎn)混合器（或者搖床、高速均質(zhì)器）
4. 酶標(biāo)板振蕩器
5. 渦旋混合器
6. 離心機(jī)
7. 50mL離心管
8. 1.5mL離心管
9. 定性濾紙
10. 過(guò)濾漏斗
11. 天平：感量0.01g

1. 試劑

1. 純水（蒸餾水、去離子水）

1. 樣品處理

5.1谷物（玉米、小麥、大麥、大米、大豆）：

1. 稱取5.0g粉碎樣品于50mL離心管中，加入25.0mL樣品提取液純水,置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩10分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì)3分鐘，或搖床上振蕩40分鐘），3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。
2. 將上層提取液用普通濾紙過(guò)濾，吸取100μL濾液置于1.5mL離心管中，加入400μL DON稀釋緩沖液A，用渦旋混合器混勻。

稀釋倍數(shù)：25

5.2飼料（高靈敏度）：

1. 稱取5.0g粉碎樣品于50mL離心管中，加入25.0mL樣品提取液純水,置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩10分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì)3分鐘，或搖床上振蕩40分鐘），3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。
2. 將上層提取液用普通濾紙過(guò)濾，測(cè)pH值，如果不在pH6-8范圍內(nèi)，請(qǐng)用酸或堿，進(jìn)行調(diào)整。
3. 吸取100μL濾液置于1.5mL離心管中，加入400uL DON稀釋緩沖液B，用渦旋混合器混勻。

稀釋倍數(shù)：25

5.3飼料：

1. 稱取5.0g粉碎樣品于50mL離心管中，加入25.0mL樣品提取液純水,置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩10分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì)3分鐘，或搖床上振蕩40分鐘），3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。
2. 將上層提取液用普通濾紙過(guò)濾，測(cè)pH值，如果不在pH6-8范圍內(nèi)，請(qǐng)用酸或堿，進(jìn)行調(diào)整。
3. 吸取50μL濾液置于1.5mL離心管中，加入450uL DON稀釋緩沖液B，用渦旋混合器混勻。

稀釋倍數(shù)：50

5.4發(fā)酵液：

1. 吸取40μL液體樣品置于1.5mL離心管中
2. 加入960μL DON稀釋緩沖液B，用渦旋混合器混勻。

稀釋倍數(shù)：25

5.5尿液樣品：

1. 取5mL待檢樣品于15mL離心管中，3000r/min，離心10分鐘
2. 吸取100μL離心后澄清樣品置于1.5mL離心管中
3. 加入400μL DON稀釋緩沖液A，用渦旋混合器混勻。

稀釋倍數(shù)：5

6． 酶聯(lián)免疫分析程序

6.1測(cè)定之前注意事項(xiàng)

1. 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。
2. 使用后迅速將試劑放入2-8℃冷藏。
3. 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。
4. 所有溫育過(guò)程應(yīng)避免陽(yáng)光直射，并按要求用蓋板覆蓋住酶標(biāo)板。

6.2溶液的配制

1. 提取液的配制:純水（或蒸餾水、去離子水）。
2. 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用純水稀釋10倍后使用。（例如：取10 mL 濃縮液+90 mL純水, 可以用于32孔的檢測(cè)）。

6.3測(cè)定程序

1. 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶標(biāo)板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔袋封好置2-8℃冷藏保存。
2. 吸取50μL 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品分別加至相應(yīng)的微孔（雙孔）中，然后各加入50μL的DON酶標(biāo)抗原、50μL的DON抗體，加蓋，在室溫溫育30分鐘（每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必須使用新的吸頭）。
3. 倒出孔中的液體，每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液，置于酶標(biāo)板振蕩器上振蕩30秒（或者手工振蕩），重復(fù)操作四次。洗完后用力在吸水紙上拍干。
4. 每孔加入150μL底物，室溫避光溫育10分鐘。
5. 每孔加入50μL 終止液。
6. 置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測(cè)定吸光度值（OD值），參比波長(zhǎng)630nm。（iELisa全自動(dòng)酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值）。

7.  結(jié)果判定

1. 所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以DI一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B<蘇b>0）再乘以*，即百分吸光度值。

以嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度值（ppb）為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計(jì)算出樣本溶液濃度。利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。

1. 樣品的實(shí)際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
2. 如果測(cè)定值超出檢測(cè)范圍，樣品提取溶液按一定的比例用純水進(jìn)行稀釋。

8.  注意事項(xiàng)

1. 室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會(huì)導(dǎo)致數(shù)值偏低。
2. 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥過(guò)久的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板排干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對(duì)光敏感，避免直接暴露在光線下。
4. 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn)液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。
5. 終止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。
6. 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，也不要混合使用不同批次的試劑盒，這樣會(huì)引起測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。
7. 試劑盒的儲(chǔ)存條件是2-8℃，切勿冷凍。

9.  試劑盒的性能指標(biāo)

1. 檢測(cè)限LOD: 谷物0.15ppm（mg/kg），飼料0.25ppm（mg/kg），發(fā)酵液0.15ppm（mg/kg）,尿液0.05ppm（mg/kg）。（LOD：空白樣品測(cè)定值+2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差SD）
2. 定量限LOQ: 谷物0.25ppm（mg/kg），飼料0.5ppm（mg/kg），發(fā)酵液0.25ppm（mg/kg）,尿液0.1ppm（mg/kg）。
3. 定量檢測(cè)范圍：谷物0.25-6.0ppm，飼料0.5-12.0ppm，發(fā)酵液0.25-6.0ppm,尿液0.1-1.0ppm。