蛋白純化親和層析原理

下圖中圓球表示載體,球上黑色箭頭表示配基。當(dāng)各種不同功能的高分子物質(zhì)(分別以方塊、半圓和三角缺口來表示配基結(jié)合部位)通過時(shí),只有帶三角缺口的高分于物質(zhì)能與固相上的配基專一結(jié)合，其它高分子物質(zhì)則不受阻礙地流出，然后改變洗脫條件使分離目的物解離而洗脫下來。

(6)對(duì)酶及微生物侵蝕穩(wěn)定，價(jià)格合理。

2，蛋白純化親和層析載體簡(jiǎn)介

三，親和吸附和洗脫

   純化蛋白質(zhì)的親和層析基本用柱法。在上柱時(shí)應(yīng)選擇配基和目的物之間作用的離子強(qiáng)度和pH組成,使最有利于形成親和絡(luò)合物，一般則選取中性pH作為吸附條件。樣品應(yīng)溶于親和層析柱的平衡緩沖液中,或用平衡緩沖液進(jìn)行透析。上柱速度盡可能慢，對(duì)溫度不敏感的物質(zhì)，室溫純化即可；對(duì)溫度敏感的物質(zhì)，可以采用在4℃下純化，通常的親和層析圖譜如下圖。

     樣品上柱后分離目的物先緊密地吸附在親和柱上,用平衡緩沖液洗滌時(shí)層析譜上出現(xiàn)第一個(gè)雜蛋白的峰。繼續(xù)用大量平衡緩沖液充分洗滌，必要時(shí)用不同緩沖液洗滌以除去非專一吸附的雜質(zhì),使柱上只留下專一吸附的目的物。然后改變緩沖液，要求選擇能減弱純化目的物與親和吸附劑之間吸附力的條件,使絡(luò)合物解離洗出，圖譜上出現(xiàn)第二個(gè)峰。一般洗脫方法是改變緩沖液的pH，改變離子強(qiáng)度或同時(shí)改變兩者。洗脫蛋白質(zhì)大多數(shù)用0.1mol/L稀醋酸或0.01mol/L稀鹽酸，如果目的物會(huì)被酸破壞，可使用0.1mol/L氫氧化銨洗脫。蛋白質(zhì)洗出后應(yīng)立刻中和、稀釋透析、重折疊為天然結(jié)構(gòu)恢復(fù)蛋白質(zhì)活性。

      除改變緩沖液pH作為洗脫方法以外，尚有用可溶性配基作競(jìng)爭(zhēng)性洗脫。例如用較高濃度的抑制劑、輔酶或底物,競(jìng)爭(zhēng)洗脫酶。用各種糖或低聚糖苷從固定化的植物凝集素親和吸附系統(tǒng)上洗脫專一吸附的糖蛋白目的物。用這類洗脫劑的優(yōu)點(diǎn)還在于它又一次地利用了生物專一性。但這種洗脫方法所得蛋白質(zhì)溶液往往較稀，并含有可溶性洗脫劑，這可以用透析和凝膠過濾法除去。有些抗原和抗體結(jié)合力特別強(qiáng)，上述方法有時(shí)尚不能洗脫則可試用鹽酸胍、尿素等蛋白促溶劑作為洗脫劑，洗脫的蛋白在適當(dāng)處理后能恢復(fù)活力者才適用。當(dāng)分離目的物洗脫下來后可連續(xù)使用大量洗脫液洗滌親和柱，再用平衡緩沖液使親和柱充分平衡，經(jīng)過這樣處理，親和柱就可以重復(fù)使用。

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