BL21（DE3） Electro感受態(tài)細(xì)胞

BL21(DE3) Electroporation-Competent Cell                  50μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                                        10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                                                 -80℃（6個月）

基因型

F^- ompT hsdS_B(r_B^- m_B^- ) gal dcm(DE3)

產(chǎn)品說明

BL21(DE3)為Lon蛋白酶和OmpT外膜蛋白酶缺陷菌株。λ噬菌體DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶，該區(qū)整合于BL21的染色體上，所以稱為BL21(DE3)。BL21(DE3)菌株可同時表達(dá)T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。唯地生物生產(chǎn)的BL21(DE3)電擊感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率達(dá)1×10¹⁰ cfu/μg DNA，可用于各種多肽，蛋白表達(dá)文庫的構(gòu)建。

操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的BL21(DE3)電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5 分鐘，待其融化，加入目的DNA (質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物)并用手打EP管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。

       A. 測定轉(zhuǎn)化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質(zhì)粒 pUC19；

       B. 對于連接產(chǎn)物，大部分公司的T4連接酶反應(yīng)體系或50度反應(yīng)重組體系可與BL21(DE3)電擊感受態(tài)混合后電擊轉(zhuǎn)化，           無需進(jìn)行DNA純化，但DNA濃度不能過高，DNA濃度不超過100 ng/μl，體積不超過5 μl/50 μl感受態(tài)。

       C. 對鹽濃度較高的DNA溶液或反應(yīng)體系請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM                   EDTA)重懸，然后與BL21(DE3)電擊感受態(tài)混合進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。

  3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。

  4. 啟動電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)，也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參    數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。

  5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養(yǎng)基（室溫），用1ml 槍吹吸電擊杯底部      數(shù)次混勻后，轉(zhuǎn)移到50 ml離心管（BD Falcon 50 ml錐形離心管等），向離心管中補加S.O.C. 培養(yǎng)基至10 ml。37℃，      225 rpm復(fù)蘇60分鐘。

  6. 5000 rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C平板上（因菌量較大，若全部涂板請選用      直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個）。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)13-17小時。

S.O.C 培養(yǎng)基配方

2% Tryptone

0.5% Yeast Extract

10 mM NaCl

2.5 mM KCl

10 mM MgCl₂

10 mM MgSO₄

20 mM glucose

PH-7.0

S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain

maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983). 

注意事項

1. 加入DNA時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。

2. 電擊感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會增加弧光放電風(fēng)險。

3. 當(dāng)DNA不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時，轉(zhuǎn)化效率急劇下降。

4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo)，增大在含有細(xì)胞和DNA的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險。

5. 若轉(zhuǎn)化大質(zhì)粒或想獲得較高轉(zhuǎn)化效率，推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。

6. 對于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，部分公司的連接體系或重組體系(例如：Thermo，NEB公司的T4 連接酶系統(tǒng)，NEB，天根的50度反應(yīng)重組系統(tǒng))可以直接與BL21(DE3)電擊感受態(tài)混合后電擊轉(zhuǎn)化，無需純化，但DNA濃度不能過高，好不超過100 ng/μl。過高濃度連接產(chǎn)物或過大體積連接產(chǎn)物會降低轉(zhuǎn)化效率，增加弧光放電的風(fēng)險。

7. 混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作，吸取感受態(tài)細(xì)胞時避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細(xì)胞膜，降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

8. 電擊感受態(tài)細(xì)胞好保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲存會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會下降。