人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480源自原位直腸腺癌，和SW620細(xì)胞源自同一病人一年后的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。CSAp和直腸抗體3陰性；角蛋白免疫過(guò)氧化物酶染色陽(yáng)性。p53基因第273位密碼子的G→A突變引起Arg→His替代，309位密碼子的C→T突變導(dǎo)致Pro→Ser替代。人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480不表達(dá)細(xì)胞溶解酶，一種與腫瘤入侵相關(guān)的金屬蛋白酶。
一、實(shí)驗(yàn)材料
①器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口使用凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機(jī)、-70 ℃低溫冰箱、超凈工作臺(tái)等。
②試劑：0.25%胰酶、培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS)、凍存液（血清：DMSO=9:1）。
二、操作步驟
①37℃水浴預(yù)熱培養(yǎng)基。
②消化細(xì)胞。
a.在超凈臺(tái)中，棄培養(yǎng)基，加人2~5 mL PBS清洗細(xì)胞后，再加入1 mL胰酶消化細(xì)胞。
b.顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓，有細(xì)胞開(kāi)始脫離瓶壁時(shí)，加入5 ml培養(yǎng)基終止消化。
c.用移液器輕輕吹下瓶壁上剩余的細(xì)胞，并輕輕吹打?qū)⒓?xì)胞吹勻、打散。
③細(xì)胞計(jì)數(shù):
a.洗凈晾干血小板計(jì)數(shù)板和蓋玻片，將蓋玻片*覆蓋計(jì)數(shù)區(qū)。
b.充分混勻細(xì)胞，取少量(0.1~0.5 mL)細(xì)胞懸液與等體積的染色液臺(tái)盼藍(lán)混合，移液器吹吸混合均勻，用移液器取20uL混合液從蓋玻片兩端（與中間凹槽平行的兩端）分別打入細(xì)胞，以細(xì)胞懸液剛好浸濕蓋玻片為佳。
c.顯微鏡下，數(shù)4個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的總細(xì)胞數(shù)，無(wú)活性細(xì)胞染成藍(lán)色，活細(xì)胞不被染色。
d.細(xì)胞密度=（細(xì)胞總數(shù)/4）×10000×2。
注意：這里10000是不變的，因?yàn)橛?jì)數(shù)的細(xì)胞是在體積為10-4 mL計(jì)數(shù)池內(nèi)，將4個(gè)計(jì)區(qū)的細(xì)胞數(shù)除以4取平均數(shù)，乘以2是補(bǔ)償加等體積臺(tái)盼藍(lán)形成的稀釋。
e.細(xì)胞活性=活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。
注意：當(dāng)細(xì)胞密度高時(shí)，可調(diào)整細(xì)胞懸液和臺(tái)盼藍(lán)的比例，計(jì)數(shù)時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可。
f.當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到傳代密度且細(xì)胞活性在90%以上時(shí)，可以凍存細(xì)胞。
④在超凈臺(tái)中將要凍存的細(xì)胞移入離心管，1000 r/min離心5 min 。
⑤棄上清，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5×106~1×107個(gè)/mL。
⑥將細(xì)胞懸液分裝到凍存管中，每管1 mL。將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴(yán)，否則復(fù)蘇時(shí)易出現(xiàn)爆裂。
⑦貼上標(biāo)簽，寫明細(xì)胞種類，凍存日期。
⑧將裝有細(xì)胞的凍存管放入程序降溫凍存盒，4℃下存放30 min，轉(zhuǎn)放-20℃冰箱4 h，然后放入-70 ℃冰箱中過(guò)夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)(-196℃)。
三、注意事項(xiàng)
①DMSO常溫下為液態(tài)，4℃冰箱放置時(shí)為固態(tài)。
②現(xiàn)多用塑料螺口小瓶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凍存，使用方便而且不會(huì)炸裂，但如質(zhì)量不好，有時(shí)密封不嚴(yán)，因而使用前要仔細(xì)檢查，凍存時(shí)用膠布將瓶口纏繞包緊以防密封不嚴(yán)。如安瓿瓶保存細(xì)胞時(shí)，需要用火焰將安瓿瓶熔封，熔封時(shí)必須保證安瓿瓶*封閉，同時(shí)注意不能使安瓿瓶?jī)?nèi)細(xì)胞懸液的濕度升高；凍存時(shí)，首先將安瓿瓶直立放置于塑料盆或小紙盒中，周圍固定，以免傾倒，因?yàn)榘碴称款i部一般較薄，凍存時(shí)易被膨脹的冰擠破；安瓿瓶易炸裂，解凍時(shí)注意個(gè)人防護(hù)。
細(xì)胞凍存后，要定期檢查液氮數(shù)量，如發(fā)現(xiàn)液氮揮發(fā)一半時(shí)要及時(shí)補(bǔ)充,補(bǔ)加液氮時(shí)要做好眼、手、腳等身體暴露部位的防護(hù)以免凍傷。細(xì)胞在液氮中儲(chǔ)存時(shí)間理論上是無(wú)限的。但為妥善起見(jiàn)，特別是很多未被凍存過(guò)的細(xì)胞在*凍存后要在短期內(nèi)復(fù)蘇一次以觀察細(xì)胞對(duì)凍存的適應(yīng)性。已建系的細(xì)胞，盡量也每年取一支復(fù)蘇一次后， 再繼續(xù)凍存。

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