人腎小管上皮細(xì)胞HK-2屬源于正常腎的近曲小管細(xì)胞，通過導(dǎo)入HPV-16 E6/E7基因而獲得永生化。將含有HPV- 16 E6/E7基因的重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pL XSN 16 E6/E7轉(zhuǎn)染外生包裝細(xì)胞Psi-2；Psi-2細(xì)胞產(chǎn)生的病毒再去感染兼嗜性包裝細(xì)胞系PA317，最后將PA317細(xì)胞產(chǎn)生的病毒顆粒導(dǎo)入正常的腎皮質(zhì)近曲小管細(xì)胞。Southern和FISH分析顯示， HK- 2細(xì)胞來源于單克隆。PCR檢測證實，HK 2細(xì)胞基因組中含有E6/E7基因。

一．實驗所需材料
①儀器：CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡超凈臺、離心機、37℃水浴鍋。
②材料：于液氮中保存的人腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞凍存管、培養(yǎng)瓶、離心管、移液管、巴斯德吸管、廢液缸、75%酒精棉球、酒精燈、記號筆、鑷子、滅菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
③試劑：*培養(yǎng)基（RPM11640或DMEM）、0.25%胰蛋白酶、PBS液。
二．實驗操作步驟
①調(diào)配37- 40℃的溫水，或?qū)⒑銣厮∠涞臏囟日{(diào)節(jié)至37-40℃。
②操作者戴上眼鏡或面罩、戴好手套，將要復(fù)蘇的細(xì)胞凍存管從液氮罐中取出，迅速將細(xì)胞凍存管放人37~ 40℃水浴鍋中，可用鑷子夾住細(xì)胞凍存管，不斷輕搖至*融化（盡量在1min內(nèi)完成）。
③將融化好的細(xì)胞凍存管放入離心機，800-1000r/min離心5 min。
④離心后，細(xì)胞下沉，在超凈工作臺中，倒棄上清液，用毛細(xì)管吸適量營養(yǎng)液加人細(xì)胞凍存管中，并輕輕吹吸數(shù)次，將下沉的細(xì)胞吹散懸浮后吸人加有適量營養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置5%CO2、37℃孵箱培養(yǎng)。次日可以換液，棄去漂浮的死亡細(xì)胞，此時存活的細(xì)胞大部分可貼壁生長并增殖，一般一支細(xì)胞凍存管復(fù)蘇后接種一瓶，培養(yǎng)3~5d方能長好。根據(jù)需要及細(xì)胞生長情況進行抗體活性的檢測、細(xì)胞的傳代、擴大培養(yǎng)或細(xì)胞的凍存等。
三．注意事項
①整個操作都需在無菌條件下操作，嚴(yán)防污染。
②將細(xì)胞凍存管從液氨罐中拿出時，要注意防止人員凍傷：如果安瓿塔封不嚴(yán)，在保存過程中液氨進人安瓿中，從液氮罐中取出時由于溫度升高導(dǎo)致液氨急速氣化而爆炸，使安瓿變得粉碎，飛濺的玻璃碎片可傷害手及面部等。為了防止液氮揮發(fā)引起爆炸工作人員盡量佩戴眼鏡或面罩，戴手套。安瓿投人存放溫水的器皿中反應(yīng)后立即把蓋子扣上，以防發(fā)生意外。
③在細(xì)胞復(fù)蘇操作時，應(yīng)注意融化凍存細(xì)胞速度要快，可不時搖動安瓿或冷凍管，使之盡快通過最易受損的溫度段(-5~0℃)。這樣復(fù)蘇的凍存細(xì)胞存活率高，生長及形態(tài)良好。然而，由于凍存的細(xì)胞還受其他因素的影響，有時也會有部分細(xì)胞死亡。此時，可將不貼壁、飄浮在培養(yǎng)液上（已死亡）的細(xì)胞輕輕倒掉，再補以適量的新培養(yǎng)液，也會獲得較為滿意的結(jié)果。
④細(xì)胞復(fù)蘇時應(yīng)根據(jù)細(xì)胞對營養(yǎng)的要求選擇不同的培養(yǎng)液，如一般細(xì)胞復(fù)蘇時用DMEM培養(yǎng)液；雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇時所用的營養(yǎng)液為含20%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，且在培養(yǎng)液中要加入一定量的飼養(yǎng)細(xì)胞。

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