人結(jié)腸癌細胞SW480源自原位直腸腺癌，和SW620細胞源自同一病人一年后的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。CSAp和直腸抗體3陰性；角蛋白免疫過氧化物酶染色陽性。p53基因第273位密碼子的G→A突變引起Arg→His替代，309位密碼子的C→T突變導致Pro→Ser替代。人結(jié)腸癌細胞SW480不表達細胞溶解酶，一種與腫瘤入侵相關的金屬蛋白酶。
一、實驗材料
①器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口使用凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機、-70 ℃低溫冰箱、超凈工作臺等。
②試劑：0.25%胰酶、培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS)、凍存液（血清：DMSO=9:1）。
二、操作步驟
①37℃水浴預熱培養(yǎng)基。
②消化細胞。
a.在超凈臺中，棄培養(yǎng)基，加人2~5 mL PBS清洗細胞后，再加入1 mL胰酶消化細胞。
b.顯微鏡下觀察到細胞變圓，有細胞開始脫離瓶壁時，加入5 ml培養(yǎng)基終止消化。
c.用移液器輕輕吹下瓶壁上剩余的細胞，并輕輕吹打?qū)⒓毎祫?、打散?br />③細胞計數(shù):
a.洗凈晾干血小板計數(shù)板和蓋玻片，將蓋玻片*覆蓋計數(shù)區(qū)。
b.充分混勻細胞，取少量(0.1~0.5 mL)細胞懸液與等體積的染色液臺盼藍混合，移液器吹吸混合均勻，用移液器取20uL混合液從蓋玻片兩端（與中間凹槽平行的兩端）分別打入細胞，以細胞懸液剛好浸濕蓋玻片為佳。
c.顯微鏡下，數(shù)4個計數(shù)區(qū)的總細胞數(shù)，無活性細胞染成藍色，活細胞不被染色。
d.細胞密度=（細胞總數(shù)/4）×10000×2。
注意：這里10000是不變的，因為計數(shù)的細胞是在體積為10-4 mL計數(shù)池內(nèi)，將4個計區(qū)的細胞數(shù)除以4取平均數(shù)，乘以2是補償加等體積臺盼藍形成的稀釋。
e.細胞活性=活細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。
注意：當細胞密度高時，可調(diào)整細胞懸液和臺盼藍的比例，計數(shù)時乘以相應的稀釋倍數(shù)即可。
f.當細胞密度達到傳代密度且細胞活性在90%以上時，可以凍存細胞。
④在超凈臺中將要凍存的細胞移入離心管，1000 r/min離心5 min 。
⑤棄上清，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細胞的最終密度為5×106~1×107個/mL。
⑥將細胞懸液分裝到凍存管中，每管1 mL。將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復蘇時易出現(xiàn)爆裂。
⑦貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。
⑧將裝有細胞的凍存管放入程序降溫凍存盒，4℃下存放30 min，轉(zhuǎn)放-20℃冰箱4 h，然后放入-70 ℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)(-196℃)。
三、注意事項
①DMSO常溫下為液態(tài)，4℃冰箱放置時為固態(tài)。
②現(xiàn)多用塑料螺口小瓶對細胞進行凍存，使用方便而且不會炸裂，但如質(zhì)量不好，有時密封不嚴，因而使用前要仔細檢查，凍存時用膠布將瓶口纏繞包緊以防密封不嚴。如安瓿瓶保存細胞時，需要用火焰將安瓿瓶熔封，熔封時必須保證安瓿瓶*封閉，同時注意不能使安瓿瓶內(nèi)細胞懸液的濕度升高；凍存時，首先將安瓿瓶直立放置于塑料盆或小紙盒中，周圍固定，以免傾倒，因為安瓿瓶頸部一般較薄，凍存時易被膨脹的冰擠破；安瓿瓶易炸裂，解凍時注意個人防護。
細胞凍存后，要定期檢查液氮數(shù)量，如發(fā)現(xiàn)液氮揮發(fā)一半時要及時補充,補加液氮時要做好眼、手、腳等身體暴露部位的防護以免凍傷。細胞在液氮中儲存時間理論上是無限的。但為妥善起見，特別是很多未被凍存過的細胞在*凍存后要在短期內(nèi)復蘇一次以觀察細胞對凍存的適應性。已建系的細胞，盡量也每年取一支復蘇一次后， 再繼續(xù)凍存。

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