質(zhì)粒表達(dá)載體 返回列表頁

質(zhì)粒表達(dá)載體注意事項(xiàng)：轉(zhuǎn)化前請(qǐng)準(zhǔn)確查找該質(zhì)粒相應(yīng)的抗生素名稱、抗生素使用濃度、感受態(tài)名稱和培養(yǎng)溫度。
1、收到質(zhì)粒干粉后請(qǐng)先5000rpm離心1min，再加入20μl~50μl無菌水或 pH8.0 的 1*TE緩沖液來溶解質(zhì)粒，室溫放置1min；

2、從-80℃冰箱中取出相應(yīng)的感受態(tài)，置于冰盒上解凍，并做好標(biāo)記；

3、取2μl質(zhì)粒加至100μl感受態(tài)中，冰浴30min；

4、42℃熱激90s，再冰浴2min；

5、加入900μl無抗的LB液體培養(yǎng)基，180rpm震蕩培養(yǎng)45min；

6、6000rpm離心5min，僅留100ul上清混勻菌體沉淀；

7、混勻后的菌液加至對(duì)應(yīng)抗性的LB平板上，倒入適量玻璃珠，涂勻液體；

8、將平板正向培養(yǎng)1h，再倒置培養(yǎng)12h~16h；

9、挑取單克隆菌落至對(duì)應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)12h~16h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要提取質(zhì)粒

　　目前，載體主要有非病毒和病毒兩大類。非病毒載體可以實(shí)現(xiàn)基因的順式中表達(dá)，周期較短，操作簡(jiǎn)單。病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)目的序列的效果。對(duì)于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，使用慢病毒載體，能大大提高目的基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，能夠比較方便快捷地實(shí)現(xiàn)目的基因的長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)。

　　可以根據(jù)您的需要?jiǎng)?chuàng)造新的基因（質(zhì)粒構(gòu)建），表達(dá)后可擁有新的蛋白質(zhì)，即通常說的重組蛋白或融合蛋白（質(zhì)粒表達(dá)）。我舉個(gè)例子，加入蛋白質(zhì)ABC和DEFG分別由三個(gè)結(jié)構(gòu)域和四個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，而你需要分子量小且具有第一個(gè)蛋白A結(jié)構(gòu)域的功能和第二個(gè)蛋白中G結(jié)構(gòu)域的功能，那么你可將AG基因克隆，裝入載體后進(jìn)行表達(dá)，這樣產(chǎn)生了新蛋白AG。當(dāng)然這只是理論上，新蛋白表達(dá)后是否能夠具有原來AG的功能，能否表達(dá)出來，表達(dá)量高低等等都是你所要考慮的問題。

　　一、載體的選擇及如何閱讀質(zhì)粒圖譜

　　目前，載體兩大類,其中質(zhì)粒DNA是一種新的非病

　　毒轉(zhuǎn)基因載體。

　　一個(gè)合格質(zhì)粒的組成要素:

　　(1）復(fù)制起始位點(diǎn)Ori即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。原核生物DNA 分子中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。而

　　真核生物DNA分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。

　　(2）抗生素抗性基因可以便于加以檢測(cè)，如 Amp+ ,Kan+(3）多克隆位點(diǎn)MCS克隆攜帶外源基因片段

　　(4)P/E啟動(dòng)子/增強(qiáng)子

　　(5 )Terms終止信號(hào)

　　(6）加poly (A）信號(hào)可以起到穩(wěn)定mRNA 作用

　　選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時(shí)要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)。如果構(gòu)建的目

　　的是要表達(dá)一個(gè)特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。載體選擇主要考慮下述3點(diǎn):

　　【1】構(gòu)建DNA重組體的目的，克隆擴(kuò)增/基因表達(dá)，選擇合適的克隆

　　載體/表達(dá)載體。

　　【2】.載體的類型:

　　(1）克隆載體的克隆能力一據(jù)克隆片段大小(大選大，小選小)。如

　　<10kb選質(zhì)粒。

　　(2）表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類型一原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細(xì)胞表

　　達(dá)載體。

　　(3)對(duì)原核表達(dá)載體應(yīng)該注意:選擇合適的啟動(dòng)子及相應(yīng)的受體菌，

　　用于表達(dá)真核蛋白質(zhì)時(shí)注意克服4個(gè)困難和閱讀框錯(cuò)位;表達(dá)天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考。

　　【3】載體MCS中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接，不能產(chǎn)生閱讀框架錯(cuò)位。

　　綜上所述，選用質(zhì)粒做載體的5點(diǎn)要求:

　　(1）選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（ 1—1.5kb）→不易損壞，在細(xì)菌里

　　面拷貝數(shù)也多（也有大載體）;

　　(2）一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般10個(gè)以上的拷

　　貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10個(gè)。

　　(3）必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地;

　　(4）必需有易檢測(cè)的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr(試一試)。

　　(5)滿足自己的實(shí)驗(yàn)需求，是否需要包裝病毒，是否需要加入熒光標(biāo)記，

　　是否需要加入標(biāo)簽蛋白，是否需要真核抗性（如 Puro、G418）等等。

　　無論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體DNA進(jìn)行切割，獲得線性載體分子，以便于與目的基因片段進(jìn)行連接。