樣品前處理對(duì)于成功的肽譜分析至關(guān)重要。這可能是一個(gè)耗時(shí)的過程，其中可能需要針對(duì)酶解的各種蛋白質(zhì)優(yōu)化多個(gè)步驟。對(duì)于肽譜分析樣品體積較大的用戶可能想要通過自動(dòng)化提高速度并改善重現(xiàn)性。

使用三氟乙酸作為離子對(duì)試劑可獲得更出色的峰形，并且 AdvanceBio 肽譜分析色譜柱是該分離的理想選擇。該色譜柱含有 120 ? 孔徑的 Poroshell 顆粒，并提供優(yōu)異的分離度和峰容量，且無需采用 UHPLC 儀器。對(duì)于使用質(zhì)譜檢測的應(yīng)用，通常優(yōu)先選擇甲酸作為離子對(duì)試劑。在此類情況下，AdvanceBio Peptide Plus 色譜柱將提供更出色的分離譜圖。AdvanceBio Peptide Plus 也推薦用于需要采用較大的樣品載樣量以檢測微量雜質(zhì)的情況。對(duì)于親水性極強(qiáng)的小分子肽，推薦使用 AdvanceBio 肽譜分析以實(shí)現(xiàn)更好的保留。

處理蛋白質(zhì)以增強(qiáng)肽譜分離在分析前，需要很好地了解蛋白質(zhì)酶解的步驟，這有助于確保酶解過程完整、成功地進(jìn)行，以及幫助您更自信地選擇策略。通常情況下，酶解方法需要一套獨(dú)立的開發(fā)方案，以提供充足穩(wěn)定的樣品進(jìn)行 LC 進(jìn)樣。雖然酶解過程的優(yōu)化有許多選擇可以考慮，但還是需要遵循一些常用方法。蛋白質(zhì)酶解可分為五個(gè)步驟，如表 1 中總結(jié)：(1) 樣品前處理，(2) 選擇裂解試劑，(3) 還原/烷基化，(4) 酶解過程，(5) 富集/純化。

表 1. 蛋白質(zhì)酶解的五個(gè)步驟

在選擇肽譜分析色譜柱和方法時(shí)，終往往是依據(jù)所分析的蛋白質(zhì)和工作流程的目的而決定常用的肽譜分析色譜柱方法（特別是在生物制藥領(lǐng)域）是反相色譜法 (RPC)。出色的分離能力及揮發(fā)性流動(dòng)相（與質(zhì)譜儀兼容）的使用，使得這種技術(shù)成為大多數(shù)多肽分離中的主要 HPLC 方法。其分離速度和效率均優(yōu)于其他的 HPLC 分離模式，可謂是肽譜分析的“理想之選"圖 1 顯示了使用方法 A 和 B，通過 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色譜系統(tǒng)分離 NISTmAb 胰蛋白酶酶解產(chǎn)物得到的色譜圖。選取 8 個(gè)峰用于后續(xù)的保留時(shí)間精度和峰容量計(jì)算。

一般情況，需要很好地了解多肽特定的色譜柱要求，以及色譜方法開發(fā)過程來開發(fā)實(shí)用性 RPC 肽譜分析方法。雖然很多相同的色譜原則同時(shí)適用于多肽和小分子分離，但在優(yōu)化多肽方法、獲取可重現(xiàn)的穩(wěn)定分離中，還是有許多條件特異性變量。色譜柱選擇、色譜柱質(zhì)量、流動(dòng)相選擇及檢測要求均是肽譜分離的重要因素，可大大改善肽譜的質(zhì)量。

為獲取可靠、分離度良好的肽譜分離，其中重要的因素是選擇合適的色譜柱。色譜柱孔徑、填料類型和粒徑、鍵合相化學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定性（化學(xué)床和填充床）在改善肽譜分離、優(yōu)化策略和光譜分析中有著重要作用。對(duì)于多肽分離，首選的色譜柱孔徑范圍為 100 ?–120 ?，而優(yōu)化的固定相選擇通常為 C18。雖然一些商業(yè)化色譜柱可針對(duì)多肽分離提供低至 60 ? 的孔徑，但是這些色譜柱常用于較小肽段碎片或標(biāo)準(zhǔn)品的分析。同樣地，一些較小的鍵合相碳鏈長度也在使用中，但這與特定的方法相關(guān)，在獲取寬范圍 的疏水性多肽保留時(shí)，實(shí)用性較為有限。

由于多肽的擴(kuò)散系數(shù)較高，因此其分離的塔板數(shù)較小，適合于在較低流速下，使用更小直徑的全多孔色譜柱材料。由此衍生出亞 2 µm 的填料，用以更高效的肽譜分析。但是目前，表面多孔色譜柱越來越多的使用于生物分離（尤其是在生物制藥行業(yè)），因?yàn)檫@種材料解決了蛋白質(zhì)和多肽的質(zhì)量擴(kuò)散問題。這些色譜柱的擴(kuò)散路徑更短，可在較高的線性速度下分離較大的分子，不會(huì)由于粒徑的減少而出現(xiàn)系統(tǒng)反壓增加的問題。圖 3 所示為使用表面多孔色柱所得的快速高分離度肽譜示例。

色譜柱質(zhì)量（多次運(yùn)行間的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性）是維持肽譜分離重現(xiàn)性和穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，有時(shí)會(huì)被忽略。反相多肽分離常在低 pH(pH < 3)、高溫下(> 40 °C)進(jìn)行。

肽譜分析依賴于色譜柱的可重現(xiàn)操作，以獲取準(zhǔn)確的指紋圖譜和重復(fù)驗(yàn)證的方案。在為肽譜分析選擇一種色譜柱時(shí)，整個(gè)決策流程中應(yīng)優(yōu)先考慮色譜柱質(zhì)量。圖 4 所示為具有優(yōu)異可重現(xiàn)性的單克隆抗體胰蛋白酶水解物肽譜，在低 pH 和高溫條件下分離，并進(jìn)行了 LC/MS 分析。

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此外，本篇應(yīng)用文集中還包含合成肽及其雜質(zhì)的分析、對(duì)于用于肽譜分析的高通量蛋白質(zhì)酶解，AssayMAP Bravo 平臺(tái)支持自動(dòng)化樣品前處理。更多信息可供查閱。