血清血漿microRNA提取試劑盒含量較組織細胞或外周血低，市面上現(xiàn)有的試劑盒提取血清血漿小RNA的得率普遍較低，因此很難用于后續(xù)的

定量檢測。新海基因血清血漿miRNA提取試劑盒通過一步上柱即可獲得高純度miRNA，可在10min左右完成小RNA的提取，

是目前提取小RNA（<200nt）操作步驟簡單、重復性最好、小RNA產(chǎn)率最高的方法。使用該試劑盒提取的小RNA

（Small RNA）中，長度在15～200nt范圍的RNA在95%以上，基本不含有大RNA和DNA，可直接用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄、

Northern 雜交、測序等應用。

組分

名稱數(shù)量

B1804AB1804B

Serum/Plasma miRNA Reagent15ml60ml

miRNA 吸附柱25套100套

RnaseFree TE Buffer5ml5ml

儲存

室溫可保存2年。

常見問題

(1) 由于血清血漿中的miRNA含量極低，提取的miRNA濃度通常在5 ng/μl以下，因此難以用常規(guī)的NanoDrop測量濃度，建議直接使用10μl進行下游反轉(zhuǎn)錄。由于本試劑盒提取的是小RNA，該濃度下的miRNA Copy數(shù)足以進行下游檢測。

(2) 由于血清血漿中miRNA的含量低，為了獲得更可靠的實驗數(shù)據(jù)，建議使用特異性和靈敏度更好的TaqMan探針法進行miRNA的下游檢測。本試劑盒提取的miRNA并不限于其它檢測方法和用途，包括SYBR Green法檢測、二代測序、芯片等檢測領域。

(3) 新海基因的D1803血清血漿TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒為血清血漿專用，不可用于細胞和組織的miRNA檢測實驗。使用D1803獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物僅可使用本公司的HG TaqMan miRNA qPCR試劑盒（貨號：TAPXXXXX）。在使用D1803反轉(zhuǎn)錄條件下，應用貨號為TAP01511檢測內(nèi)源hsa-miR-16， Ct值通常在24左右。

(4)外源性內(nèi)參可單獨訂購cel-miR-39 標準品（貨號：B1805），每個樣品每次提取cel-miR-39的使用量為50fmol。

(5)抗凝血劑要避免使用含有肝素的凝血管，因為肝素會抑制反轉(zhuǎn)錄 (reverse tranion) 和聚合酶 (polymerase) 的反應。

血清血漿microRNA提取試劑盒恒溫擴增使用策略及實例展示

應用實例1：在以A3824-03或 A3828-03，用 LP1002引物組進行的LAMP測試。Bst4.0 SYBR Green試劑可在標準定量PCR儀或恒溫熒光儀上進行反應。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應25min的檢測結(jié)果，可以看到檢測反應<20min(達平臺期)。

應用實例2： 用 LP1002引物組進行的LAMP測試。OG變色法為終點變色策略，在反應結(jié)束后，倒置反應管，溶解管蓋上染料后，陽性樣本呈現(xiàn)出醒目的綠色，陰性表現(xiàn)出橙色，區(qū)分明顯。且該方法不受樣本類型限制，雜質(zhì)耐受性很好。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應20min后檢測結(jié)果。

應用實例3：A3825-01 紅黃變色反應（肉眼觀察）

以 體外轉(zhuǎn)錄 RNA 為模板，1-6分別為1、10 、100、1000、104和106Copy，NTC為ddH2O為模板。 上圖為加樣結(jié)束反應起

始前，下圖為 65 度反應 30min 后。

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