• 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的局限性：超過90%在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中看似安全有效的藥物，因安全性和/或有效性問題未能獲得FDA批準(zhǔn)。動(dòng)物數(shù)據(jù)在預(yù)測藥物成功方面表現(xiàn)不佳，尤其是在癌癥、阿爾茨海默病和炎癥性疾病等常見疾病中。

  
  

• 倫理和成本問題：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)存在倫理爭議，且成本高昂，例如單克隆抗體（mAb）的開發(fā)成本高達(dá)6.5億至7.5億美元，耗時(shí)長達(dá)9年。

  
  

• 政策支持：2022年，國會通過FDA現(xiàn)代化法案2.0，明確授權(quán)使用非動(dòng)物替代方法支持新藥申請，并取消了生物類似藥申請中動(dòng)物研究的要求。

【實(shí)驗(yàn)方案】Kirkstall Quasi Vivo肝臟多細(xì)胞串聯(lián)芯片模型研究輻射性肝損傷及藥物干預(yù)

 引言

輻射性肝損傷（Radiation-Induced Liver Disease, RILD）是放療患者及核輻射暴露人群的重要并發(fā)癥，目前缺乏有效治療手段。傳統(tǒng)體外模型（如靜態(tài)培養(yǎng)或單器官芯片）難以模擬肝臟復(fù)雜的微環(huán)境及多細(xì)胞交互作用。

英國Kirkstall Quasi Vivo系統(tǒng)通過動(dòng)態(tài)流動(dòng)培養(yǎng)和多器官串聯(lián)設(shè)計(jì)，可更真實(shí)地模擬體內(nèi)生理?xiàng)l件。本研究基于Quasi Vivo系統(tǒng)構(gòu)建肝臟多細(xì)胞串聯(lián)芯片模型（肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞），用于研究輻射損傷機(jī)制及抗氧化劑NACA的干預(yù)效果。

                                    材料與方法

1. 芯片使用與細(xì)胞接種

1.1串聯(lián)器官芯片系統(tǒng)：Kirkstall Quasi Vivo串聯(lián)芯片灌流培養(yǎng)系統(tǒng)，配備肝臟多腔室芯片（含獨(dú)立肝細(xì)胞腔與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞腔，腔間通過多孔膜分隔）。

1.2細(xì)胞來源：原代人肝細(xì)胞（Hepatocytes）、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSECs）、Kupffer細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞（HSCs），購自商業(yè)供應(yīng)商（如Lonza）。

1.3 細(xì)胞接種：

  1. 肝細(xì)胞腔：以3.5×10? cells/mL密度接種至膠原/纖連蛋白包被的上腔室，培養(yǎng)基為Williams' E培養(yǎng)基（含10% FBS、1% ITS）。

  2. 非實(shí)質(zhì)細(xì)胞腔：LSECs（4×10? cells/mL）、Kupffer細(xì)胞（2×10? cells/mL）、HSCs（0.1×10? cells/mL）混合接種至下腔室，培養(yǎng)基為含2% FBS的Williams' E培養(yǎng)基。

  3. 動(dòng)態(tài)培養(yǎng)：系統(tǒng)流速設(shè)為30 μL/h，模擬肝竇血流剪切應(yīng)力，連續(xù)培養(yǎng)5天至細(xì)胞功能穩(wěn)定。

2. 輻射處理與藥物干預(yù)

2.1 輻射條件：使用X-Rad 320輻照儀，單次劑量8 Gy（基于前期劑量效應(yīng)曲線確定），對照組為0 Gy。

2.2 藥物預(yù)處理：NACA（375 μM）于輻射前3小時(shí)加入培養(yǎng)基，持續(xù)干預(yù)至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。

2.3 時(shí)間節(jié)點(diǎn)：輻射后6 h、24 h、7天收集樣本。

3. 樣品采集與分析

3.1 RNA測序：分別裂解肝細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA。全基因組RNA測序（Illumina NovaSeq 6000），分析差異表達(dá)基因（DESeq2，F(xiàn)DR<0.05）。

3.2 免疫熒光檢測： γ-H2AX（DNA損傷）、CD31（LSECs標(biāo)志）、α-SMA（HSCs活化）染色，ImageJ定量分析。

3.3 生化檢測：LDH釋放（細(xì)胞毒性）、ELISA檢測IL-6、VCAM-1（炎癥）、Triglyceride（肝細(xì)胞脂代謝）。通路分析：IPA（Ingenuity Pathway Analysis）驗(yàn)證輻射相關(guān)通路（如p53信號、鐵死亡）。

- 多器官擴(kuò)展：將肝臟芯片與腸芯片或血管芯片串聯(lián)，研究全身輻射暴露下的肝-腸/肝-血管交互作用（需額外優(yōu)化流速與培養(yǎng)基兼容性）。

本研究方案利用Kirkstall Quasi Vivo系統(tǒng)構(gòu)建動(dòng)態(tài)肝臟多細(xì)胞模型，模擬輻射性肝損傷的病理進(jìn)程，并驗(yàn)證NACA的干預(yù)效果。該模型為輻射防護(hù)藥物篩選及機(jī)制研究提供了高效、仿生的體外平臺。

輻射損傷表型：肝細(xì)胞DNA損傷（γ-H2AX↑）、脂代謝紊亂（Triglyceride↑）；LSECs死亡（CD31↓）、HSCs活化（α-SMA↑）、炎癥因子（IL-6、VCAM-1↑）。

NACA保護(hù)效應(yīng)：減少DNA損傷及細(xì)胞凋亡，抑制HSCs活化與炎癥通路。

 Kirkstall Quasi Vivo串聯(lián)芯片灌流培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)勢：

   - 動(dòng)態(tài)流動(dòng)增強(qiáng)細(xì)胞間信號傳遞，更真實(shí)模擬體內(nèi)微環(huán)境。

   - Quasi Vivo系統(tǒng)動(dòng)態(tài)剪切力促進(jìn)LSECs功能維持，多腔室設(shè)計(jì)支持肝細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞交互。串聯(lián)器官芯片擴(kuò)展?jié)摿檠芯慷嗥鞴佥椛鋼p傷提供平臺。