Sf9等昆蟲細胞培養(yǎng)常見問題及解決方案 -賽默飛

昆蟲細胞培養(yǎng)是用于外源蛋白表達的一種常見方法。對于大規(guī)模生產(chǎn)或基礎(chǔ)研究，昆蟲細胞能夠表達大量的有著復(fù)雜翻譯后修飾的蛋白質(zhì)。Gibco昆蟲培養(yǎng)基精心調(diào)配的配方可實現(xiàn)最高生長率和蛋白產(chǎn)率。該培養(yǎng)基與Gibco預(yù)適應(yīng)的細胞系聯(lián)用，可提供一種便捷系統(tǒng)，從而為您節(jié)省時間和工作量。 

Sf9細胞（IPLB-Sf-21-AE）來源于棉鈴蟲（Spodoptera frugiperda）細胞系，是從桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達重組蛋白的合適宿主。 

Gibco™ Sf9 細胞通常用于分離和增殖重組桿狀病毒儲備并生成重組蛋白。Gibco™ Sf9 細胞適應(yīng)于在 Gibco™ Sf-900™ III SFM 中進行無血清懸浮培養(yǎng)，可節(jié)省大量與培養(yǎng)適應(yīng)相關(guān)的時間和費用。Gibco™ Sf9 細胞（冷凍在 Gibco™ Sf-900™ III SFM 中）的特點如下： 
•多種表達系統(tǒng)的重組蛋白表達 
• 貼壁或懸浮培養(yǎng)時生長良好 
• 常規(guī)規(guī)格較小，可以生成均勻單層和斑塊 
• 低傳代主細胞庫的記錄譜系 
• 質(zhì)量和性能檢測 

賽默飛總結(jié)了一系列昆蟲細胞培養(yǎng)支持要點提示和技巧并建立了一個詳細的知識庫，以滿足您的各類科研需求，助您優(yōu)化試驗，獲得的結(jié)果。 

昆蟲細胞 

Sf9，Sf21，High Five™細胞與D.mel-2細胞的大小是怎樣的？ 

請參見下列關(guān)于細胞，培養(yǎng)基與細胞大小的列表： 

不同的昆蟲細胞系生長和培養(yǎng)的倍增時間是多少？ 

對于常規(guī)培養(yǎng)昆蟲細胞而言，最重要的參數(shù)是什么？ 

對于培養(yǎng)快速生長和良好活性的細胞來說，有三個主要的關(guān)鍵因素,那就是孵育溫度，換氣和細胞接種密度。為了成功培養(yǎng)快速生長的昆蟲細胞并獲得良好的細胞活性，下列表格為不同種類的昆蟲細胞提供了溫度，接種密度和換氣系統(tǒng)條件。 

3-4天傳代培養(yǎng)規(guī)劃的懸浮培養(yǎng)參數(shù) 

3-4天傳代培養(yǎng)規(guī)劃的貼壁培養(yǎng)參數(shù) 

貼壁與懸浮培養(yǎng)推薦的換氣條件 

培養(yǎng)昆蟲細胞的最佳方式是什么？ 

在轉(zhuǎn)染和噬斑實驗之前，細胞需要均勻地分布于組織培養(yǎng)板表面。這一操作能夠確保： 

· 細胞不會分布不均勻而導(dǎo)致形成不對稱的單層細胞。 

· 為轉(zhuǎn)染操作提供最大的細胞表面積。 

為了使細胞盡可能分散： 

1. 用手前后緩慢振蕩培養(yǎng)瓶或平板，之后左右振蕩。 

2. 重復(fù)以上操作四次，仔細查看以確保液體到達生長表面的所有區(qū)域。 

3. 請勿通過環(huán)狀搖動來分散細胞，因為這將導(dǎo)致細胞聚集在平板邊緣周圍，而非均勻分布。 

昆蟲細胞培養(yǎng)是否需要CO2？ 

不需要，昆蟲細胞培養(yǎng)不需要CO₂交換。 

你們提供的昆蟲細胞系之間的區(qū)別是什么？ 

Sf21細胞的形態(tài)是怎樣的？ 

請參見懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下的健康Sf21昆蟲細胞的相差成像照片。在振蕩培養(yǎng)瓶中將細胞以3×10E5活性細胞/mL的接種密度培養(yǎng)于Sf-900™ II SFM培養(yǎng)基中，并將振蕩培養(yǎng)瓶孵育于28°C非加濕型的環(huán)境空氣調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱。該圖像是使用10X和20X物鏡（分別為圖A和圖B）在接種三天后拍攝的。? 

之后的相差圖像展示的是培養(yǎng)于Sf-900™ II SFM 培養(yǎng)基中以單層貼壁細胞形式生長的Sf21昆蟲細胞。這些細胞是以5 × 10E4活性細胞/cm²的密度種植于T-25培養(yǎng)瓶中，并在28°C，非加濕型的環(huán)境空氣調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱中生長為單層細胞。該圖像是使用10X和20X物鏡（分別為圖A和圖B）在培養(yǎng)7天后拍攝的，此時培養(yǎng)物細胞長滿。 

Sf9細胞的形態(tài)是怎樣的？ 

請參見懸浮培養(yǎng)狀態(tài)下健康Sf9細胞形態(tài)的相差成像照片。在振蕩培養(yǎng)瓶中將細胞以3×10E5活性細胞/mL的起始種植密度培養(yǎng)于Sf-900™ II SFM培養(yǎng)基中，并將振蕩培養(yǎng)瓶孵育于28°C非加濕型的環(huán)境空氣調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱。該圖像是使用10X和20X物鏡（分別為圖A和圖B）在培養(yǎng)三天后拍攝的。 

接下來的相差圖像展示的是培養(yǎng)于SF-900™ II SFM培養(yǎng)基中以單層貼壁細胞形式生長的Sf9昆蟲細胞。這些細胞是以5 × 10E4活性細胞/cm2的密度種植于T-25培養(yǎng)瓶中，并在28°C，非加濕型的環(huán)境空氣調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱中生長為單層細胞。該圖像是使用10X和20X物鏡（分別為圖A和圖B）在培養(yǎng)三天后拍攝的。 

High-Five™細胞的形態(tài)是怎樣的？ 

請參見下列圖像中生長于Express Five™ SFM培養(yǎng)基中的High-Five™細胞（培養(yǎng)至第3天）。 

D.Mel 2（或Schneider S2）細胞的形態(tài)是怎樣的？ 

請參見下方圖像中懸浮生長于Drosophila-SFM培養(yǎng)基中的D.Mel 2（Schneider S2）細胞（培養(yǎng)至第2天）。 

我能否將昆蟲細胞短時間培養(yǎng)于37°C？ 

不可，我們不推薦這樣做。長期暴露于29°C以上的溫度會導(dǎo)致細胞死亡。這些細胞最好生長于27°C或室溫條件下。 

我們推薦采用Sf9或Sf21細胞進行重組病毒的轉(zhuǎn)染，純化和擴增操作。Sf9細胞的大小比較規(guī)則，易于操作，并能夠生長為適于噬斑測定的優(yōu)良單層細胞。Sf9與Sf21細胞也可用于重組蛋白的表達，不過使用High Five™細胞系可能會獲得更高的產(chǎn)量。? 

我們推薦使用High Five™細胞系來表達分泌型重組蛋白。它們適于在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，可高水平表達的重組蛋白（Davis et al., 1992） 

注意：一般來說，在優(yōu)化蛋白表達情況之前，使用一種細胞系進行表達嘗試比較方便。一旦您確定了您的重組蛋白已成功表達，即可嘗試使用其他細胞系來優(yōu)化表達水平。 

昆蟲細胞培養(yǎng)與哺乳動物細胞培養(yǎng)之間的主要區(qū)別是什么？ 

昆蟲細胞遠比許多哺乳動物細胞系更為脆弱。這些細胞在過度生長和過度分離之后，會比哺乳動物細胞出現(xiàn)更多損傷。在懸浮培養(yǎng)時一定不要讓細胞密度超過8 x 10E6細胞/mL或以低于0.5 x 10E6個細胞/mL的密度下生長。昆蟲細胞需要略高于哺乳動物細胞的滲透壓條件（340μOsM）。昆蟲細胞需要大量的O₂，特別是在蛋白表達階段。昆蟲細胞培養(yǎng)基比哺乳動物培養(yǎng)基要酸得多（pH6.0-6.4）。昆蟲細胞培養(yǎng)基是基于磷酸緩沖體系的。因此，無需使用CO₂來維持pH值。 

你們推薦在一個培養(yǎng)瓶中種植多少昆蟲細胞以達到50%的細胞融匯度？ 

*注意：這類細胞貼壁較弱，當(dāng)覆蓋80%左右的生長表面時即會融合到一起，因此，我們推薦您在培養(yǎng)板中以較低百分比的融匯度來種植這些細胞。 

我應(yīng)如何富集我的昆蟲細胞以增加細胞密度？ 

如果細胞密度過低，而且已經(jīng)培養(yǎng)了4-5天，我們推薦您通過100 × g離心5分鐘來富集細胞，并將其重懸于新鮮的培養(yǎng)基中。細胞在同一培養(yǎng)基體系中不應(yīng)滯留超過4-5天，因為這一時間段內(nèi)細胞會耗盡培養(yǎng)基中的養(yǎng)分，長時間暴露于較高溫度下也會導(dǎo)致培養(yǎng)基自身發(fā)生降解。當(dāng)培養(yǎng)時出現(xiàn)大量細胞碎片時，也可對細胞進行離心和富集。 

應(yīng)使用何種方法來解離添加了10%熱滅活FBS的Grace's培養(yǎng)基，Sf-900™ II SFM或Sf-900™ III SFM培養(yǎng)基中緊密粘附的Sf9和Sf21細胞？ 

Sf9與Sf21細胞應(yīng)是貼壁較弱的細胞。不過，某些Sf9和Sf21細胞能夠非常緊密地貼附于培養(yǎng)容器。我們嘗試使用過胰酶，膠原酶，透明質(zhì)酸酶，TrypLE™ Express和的TrypLE™ Select，均未能成功傳代細胞。幾次傳代之內(nèi)細胞還可能會解離，但之后就無法有效解離了。? 

最佳的方法是在T-培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)細胞。蓋緊瓶蓋，并以瓶蓋朝上的方向抓住培養(yǎng)瓶，在臺面上以中等力量敲擊瓶底2-3次，將會有60%-80%的細胞解離下來，但不會達到100%，這樣就有足夠的細胞解離下來用于傳代。如果在臺面敲擊培養(yǎng)瓶過于猛烈或次數(shù)太多，細胞活力將受到很大影響。? 

在可能條件下，我們推薦您以懸浮條件培養(yǎng)您的細胞。如果需要的話懸浮培養(yǎng)的細胞可隨時直接傳代至貼壁培養(yǎng)的條件。懸浮培養(yǎng)的細胞也能夠達到更高的細胞密度，因為細胞生長不受限于表面積。 

在復(fù)蘇凍存產(chǎn)品之前，我可將Sf9細胞傳至多少代？隨著傳代次數(shù)的增加，細胞轉(zhuǎn)染可實現(xiàn)的效率是否會下降？ 

無論何時對細胞進行計數(shù)操作，您都可通過臺盼藍分析來檢查細胞活力。如果細胞的活力在約95%以上，并且每25小時左右完成一次倍增，就可以繼續(xù)使用。如果活力下降而倍增時間延長，可轉(zhuǎn)染能力就會受到影響。傳代超過30次的細胞可能會出現(xiàn)老化跡象，蛋白合成隨之延遲。 

High Five™細胞比Sf21和Sf9細胞更難轉(zhuǎn)染么？ 

High Five™細胞較難轉(zhuǎn)染，我們通常實現(xiàn)的轉(zhuǎn)染效率為5–13%。其他細胞類型一般能達到40-50%。同時，High Five™細胞匯聚后通常不會平滑地覆蓋整個培養(yǎng)瓶表面，這些細胞看上去仍呈斑片狀，它們開始相互交疊和接觸時就開始有聚集的傾向。 

既然High Five™細胞的蛋白表達高于Sf9，我是否應(yīng)該直接使用High Five™細胞嘗試開展蛋白表達實驗？ 

我們同時推薦您以High Five™和Sf9這兩類細胞來小規(guī)模嘗試蛋白轉(zhuǎn)染生產(chǎn)實驗。通常每毫升的Sf9細胞培養(yǎng)物所生成的蛋白產(chǎn)物稍多，因為它們可于3–4 x 10E6個細胞/mL的密度下完成轉(zhuǎn)染。High Five™在>2 x 10E6個細胞/mL的密度下就已進入對數(shù)生長期，因此它們不宜在高于2 x 10E6個細胞/mL的密度下進行轉(zhuǎn)染。 

昆蟲培養(yǎng)基 

你們是否提供無血清的昆蟲培養(yǎng)基？ 

是的，我們提供各類無血清的昆蟲培養(yǎng)基。 

在將血清加入我的培養(yǎng)基之前，是否需要對其進行熱滅活操作？ 

熱滅活操作不是必需的。我們的團隊直接使用未經(jīng)熱滅活的血清，并未發(fā)現(xiàn)其對細胞生長或細胞形態(tài)有任何顯著影響。 

昆蟲細胞培養(yǎng)可使用哪些種類和濃度的殺菌劑？ 

許多抗生素都適用于昆蟲細胞。下列為常用抗生素： 

青霉素/鏈霉素：50–100 U/mL；50–100 µg/mL 

兩性霉素B(Fungizone™ 抗真菌劑）：0.25 µg/mL 

慶大霉素：500 mL培養(yǎng)基中加入0.5 mL 10 mg/mL溶液（最終濃度10 µg/mL） 

為了開展噬斑測定實驗，你們推薦使用何種培養(yǎng)基來培育Sf9或Sf21細胞？ 

我們推薦您使用我們的Grace’s supplemented昆蟲培養(yǎng)基（貨號11667037）或SF-900™培養(yǎng)基（1.3X）（貨號10967032）。? 

Grace’s Supplemented昆蟲培養(yǎng)基是2X的配方培養(yǎng)基，專為在噬斑測定實驗瓊脂糖覆蓋層中的應(yīng)用而配制。本培養(yǎng)基經(jīng)以下成份的微調(diào)：? 

· 乳清蛋白水解物 

· 酵母粉 

· L-谷氨酰胺 

· 碳酸氫鈉 

SF-900™培養(yǎng)基（1.3X）是為Sf9和Sf21細胞準(zhǔn)備的不含血清的低蛋白昆蟲細胞培養(yǎng)基，適用于在噬斑測定實驗1%的瓊脂糖覆蓋層中使用。? 

Express Five™ SFM培養(yǎng)基中的去垢劑濃度是多少？ 

24 µg/L Tween-80? 

910 µg/L Pluronic Poly-all 

你們提供的Express Five™ SFM培養(yǎng)基中含有L-谷氨酰胺么？該培養(yǎng)基中是不含蛋白質(zhì)的么？經(jīng)過過濾滅菌的么？ 

是的，我們的Express Five™ SFM含L-谷氨酰胺，1.5 g/L。是的，本品不含蛋白，并經(jīng)過無菌過濾處理。 

當(dāng)為High Five™細胞準(zhǔn)備肝素時，你們以何種溫度保存肝素溶液？ 

肝素可保存于室溫。肝素通常以10 µg/mL的濃度進行使用，盡管超出20倍的濃度也是可行的。 

你們?yōu)?/span>High-Five細胞準(zhǔn)備的無血清培養(yǎng)基中是否含有膽固醇成份？ 

這些產(chǎn)品中未添加膽固醇，不過，其中含有一些可作為膽固醇前體的酵母粉和水解物。這一情況在所有無血清昆蟲培養(yǎng)基中都很常見。 

你們是否為桿狀病毒表達應(yīng)用提供不含甲硫氨酸的培養(yǎng)基？ 

是的，我們提供不含甲硫氨酸的Grace's昆蟲培養(yǎng)基（貨號11595030）。? 

Grace's昆蟲培養(yǎng)基中包含了哪些輔劑？為什么它們以單管形式提供？ 

補充培養(yǎng)基簡稱為TNM-FH。它包含以下成份（每500 mL）： 

TC酵母粉：1.66 g，乳清蛋白水解物1.66 g，L-谷氨酰胺：0.3 g 

這些添加劑能夠幫助增加培養(yǎng)基的穩(wěn)定性和延長保質(zhì)期。請注意這些添加劑未經(jīng)消毒，須經(jīng)過濾滅菌（通過0.2 µm濾器）后方可加入。 

TNM-FH未加入熱滅活的10% FBS之前，不視為培養(yǎng)基。血清會提供額外的養(yǎng)分，同時也能夠保護懸浮培養(yǎng)條件（即旋轉(zhuǎn)器和振蕩培養(yǎng)瓶）下的細胞免受流體壓力的影響。 

如需合作轉(zhuǎn)載本文，請文末留言。 

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