基于細(xì)胞的高通量篩選為什么需要自動(dòng)化？

隨著研究人員尋求更具有時(shí)效性、成本效益和倫理性的動(dòng)物試驗(yàn)替代品，基于細(xì)胞的模型越來(lái)越普及。而且，制藥公司之間尋找強(qiáng)有力的治療候選藥物的激烈競(jìng)爭(zhēng)需要適合大量分子評(píng)估的方法。

在基于細(xì)胞的高通量篩選（HTS）試驗(yàn)中，在培養(yǎng)細(xì)胞中同時(shí)評(píng)估成百上千種化合物/條件。這些試驗(yàn)的效率和標(biāo)準(zhǔn)化是通過(guò)自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)的，特別是通過(guò)使用多通道移液頭（MPH）、384/1536孔板和快速分析系統(tǒng)。

基于細(xì)胞的HTS工作流程的主要步驟可分為：（1）細(xì)胞維持培養(yǎng)和擴(kuò)增，（2）細(xì)胞分化/3D形成，（3）化合物處理，（4）樣品制備/活細(xì)胞成像和（5）分析。細(xì)胞的維持培養(yǎng)通常需要每24-72小時(shí)干預(yù)一次，以進(jìn)行培養(yǎng)基更換和傳代。必須定期評(píng)估細(xì)胞活力和濃度/融合度，以確保培養(yǎng)物的健康，并滿足在不同規(guī)格的培養(yǎng)板中以適當(dāng)濃度接種細(xì)胞的要求。細(xì)胞分化和3D結(jié)構(gòu)的形成需要精確及時(shí)地添加專門的試劑和使用專門的實(shí)驗(yàn)室器皿。化合物處理通常在實(shí)驗(yàn)室器皿中以標(biāo)準(zhǔn)SBS格式進(jìn)行，通常為6-1536孔板。為此，向細(xì)胞中加入不同濃度的生物活性化合物（通常使用納升范圍內(nèi)的體積），孵育，然后進(jìn)行qPCR蛋白質(zhì)分析或成像。

盡管基于細(xì)胞的HTS有好處，但維護(hù)和處理細(xì)胞培養(yǎng)物需要專業(yè)知識(shí)和時(shí)間。多種參數(shù)可以影響細(xì)胞濃度、附著和存活率。此外，基于細(xì)胞的試驗(yàn)通常涉及重復(fù)性操作，且孵育/等待時(shí)間較長(zhǎng)，因此容易出錯(cuò)。自動(dòng)化液體處理設(shè)備在處理細(xì)胞培養(yǎng)物方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，這得益于工作站中的先進(jìn)技術(shù)和專用軟件。這些自動(dòng)化系統(tǒng)可以確保精確溫和的吸液和分液、受控的溫度和振蕩，無(wú)菌性，以及與第三方設(shè)備整合進(jìn)行自動(dòng)化分析。

吸液和放液

液體處理需要兩個(gè)步驟：吸液和放液。控制好這兩個(gè)步驟可以降低細(xì)胞上的剪切壓力和應(yīng)力。自動(dòng)化系統(tǒng)可以控制各種移液參數(shù)，包括：（1）吸液和放液的速度（流速），（2）吸液開始或結(jié)束時(shí)吸入的空氣量（吹出量和空氣輸送量），（3）吸液后移液頭在液體中停留的時(shí)間（沉降時(shí)間），（4）吸液和放液后移液頭移出液體的速度（交換速度），以及（5）吸頭相當(dāng)于孔的位置等。

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的一些常見(jiàn)挑戰(zhàn)是對(duì)細(xì)胞的干擾（包括在培養(yǎng)基更換過(guò)程中的吸液）、接種不均勻和涂層不均勻。吸液和放液可產(chǎn)生應(yīng)激誘導(dǎo)的自發(fā)分化和細(xì)胞死亡。通過(guò)調(diào)整移液參數(shù)，如流速和吸頭定位，可以顯著降低培養(yǎng)基更換期間發(fā)生這些事件或吸入細(xì)胞的可能性。貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)基更換需要以避免吸頭與細(xì)胞接觸的方式進(jìn)行。此外，通常手動(dòng)傾斜培養(yǎng)板以防止在培養(yǎng)基吸入過(guò)程中干擾細(xì)胞。在自動(dòng)化系統(tǒng)中，專門的傾斜模塊可確保傾斜角度一致，從而提高整個(gè)過(guò)程中的總體精度。

細(xì)胞的接種不均勻通常是由培養(yǎng)基中產(chǎn)生的泡沫引起的，這是由于加入的血清蛋白含量較高。事實(shí)上，在細(xì)胞接種過(guò)程中，氣泡可以阻礙細(xì)胞附著，導(dǎo)致細(xì)胞計(jì)數(shù)的孔間差異-特別是當(dāng)考慮96孔和384孔板上每孔生長(zhǎng)表面減少時(shí)。此外，在培養(yǎng)基分配過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡會(huì)破裂、破壞并可能殺死細(xì)胞，可通過(guò)調(diào)整流速、吹出量和空氣輸送量（放液額外吹出空氣量和吸液后額外空氣吸入量）等參數(shù)、使用表面分液和大口徑吸頭以及避免過(guò)度移液來(lái)避免氣泡形成。

圖層不均勻是粘性液體的常見(jiàn)問(wèn)題，例如用于涂敷3D細(xì)胞培養(yǎng)用凝膠的平板的基質(zhì)。同樣，調(diào)整流速、吹出體積和沉降時(shí)間等參數(shù)可以避免此類問(wèn)題，并確?；|(zhì)均勻分布，從而確保細(xì)胞均勻生長(zhǎng)。

無(wú)菌性

長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)最關(guān)鍵的調(diào)整之一是保持無(wú)菌性。諸如細(xì)菌和真菌等傳染源對(duì)真核細(xì)胞有害，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，即使少量污染也可能導(dǎo)致異常結(jié)果和不正確的科學(xué)結(jié)論。在整個(gè)過(guò)程中保持無(wú)菌可以減少污染的頻率和數(shù)量，減少細(xì)胞、資源和時(shí)間的損失。無(wú)菌條件可以通過(guò)防止病原體通過(guò)受污染的設(shè)備、培養(yǎng)基、試劑、培養(yǎng)箱、工作臺(tái)以及有缺陷或未密封的細(xì)胞培養(yǎng)容器進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)實(shí)現(xiàn)。高效微粒空氣（HEPA）過(guò)濾器和紫外燈現(xiàn)在包括在自動(dòng)化系統(tǒng)中，用于維持無(wú)菌條件以及對(duì)平臺(tái)和實(shí)驗(yàn)室器具進(jìn)行滅菌。自動(dòng)化工作流程的手動(dòng)處理減少也最大限度地減少了污染物的進(jìn)入。

活細(xì)胞成像的整合

當(dāng)貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中的匯合度達(dá)到80%時(shí)，細(xì)胞必須消化解離并轉(zhuǎn)移到其他容器中繼續(xù)生長(zhǎng)。這被稱為傳代。此外，必須定期監(jiān)測(cè)細(xì)胞活力，以確保沒(méi)有表型變化。自動(dòng)化液體處理設(shè)備可以與第三方設(shè)備集成，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行活細(xì)胞成像。自動(dòng)成像可以確保細(xì)胞在評(píng)估過(guò)程中只從最佳培養(yǎng)條件中被篩選。