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α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Arabinofuranosidase, α-L-Af）試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶試劑盒 糖代謝

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

α-L-Af 是一種能夠水解非還原呋喃阿拉伯糖殘基的糖苷酶類，使細(xì)胞壁阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯甘露聚糖等中性糖不斷解離，促進(jìn)果膠的增溶和降解。由于果實(shí)成熟過程中常常伴隨著阿拉伯糖的喪失，該酶活性在果實(shí)成熟軟化中的研究具有重大意義。

測定原理：

α-L-Af 分解對硝基酚阿拉伯呋喃糖苷生成對-硝基苯fen，后者在 400nm 有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算α-L-Af 活性。

組成：

試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 2.5ml 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

自備儀器和用品：

酶標(biāo)儀/可見分光光度計、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、96 孔板/微量石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定（在 EP 管或 96 孔板中依次加入下列試劑）：

迅速混勻，放入 37℃保溫 30min

充分混勻， 400nm 處測定吸光值A(chǔ)，計算ΔA=A 測定-A 對照。每個測定管需設(shè)一個對照管。

α-L-Af 活性計算：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y =0.00585x -0.0027；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/ml），y 為吸光值。

按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每min 產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯fen定義為一個酶活性單位。

α-L-Af 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯fen定義為一個酶活性單位。

α-L-Af 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯fen定義為一個酶活性單位。

α-L-Af 活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.08×(ΔA +0.0027)

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.07ml；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01ml；

V 樣總：加入提取液體積，1ml；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬；T：反應(yīng)時間，30min。

用 96 孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.0039x -0.0027；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/ml），y 為吸光值。

按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯fen定義為一個酶活性單位。

α-L-Af 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯fen定義為一個酶活性單位。

α-L-Af 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯fen定義為一個酶活性單位。

α-L-Af 活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.12×(ΔA +0.0027)

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.07ml；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01ml；

V 樣總：加入提取液體積，1ml；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬；T：反應(yīng)時間，30min。

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