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肉桂酸-4-羥化酶（ Cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100 管/96 樣

肉桂酸-4-羥化酶試劑盒 其他系列

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

C4H 又稱(chēng)反式肉桂酸-4-單氧化酶，多存在于高等植物、酵母、菌類(lèi)中，該酶催化肉桂酸羥化作用產(chǎn)生4-香豆酸鹽，是苯bing烷途徑中繼L-苯bing氨酸解氨酶之后的第二個(gè)關(guān)鍵酶。

測(cè)定原理：

C4H 催化肉桂酸和NADP 生成 4-香豆酸鹽和NADPH，在 340nm 下測(cè)定NADPH 生成速率，即可反映C4H 活性。

試劑的組成和配制：

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：

先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

取試劑二一瓶，加入 10ml 試劑一充分溶解混勻，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 5min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后 24h 內(nèi)用完）；

在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本和 190μl 試劑二，混勻，立即記錄 340nm 處初始吸光值A(chǔ)1 和 5min 后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

C4H 活性計(jì)算：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

C4H（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

C4H（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=643×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

C4H（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=1.286×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

C4H（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

C4H（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

C4H（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=2.572×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

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