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磷脂酶D（ Phospholipases D，PLD ）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100T/96S

磷脂酶D試劑盒 脂肪酸系列

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

磷脂酶 D（EC3.1.4.4）即磷脂酰dan堿水解酶，是催化磷酸二酯鍵水解和堿基交換反應(yīng)的一類酶的總稱，廣泛存在于高等動(dòng)植物和細(xì)菌等多種生物體中，具有參與細(xì)胞脂質(zhì)代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、生物膜形成的抗逆境脅等生理功能。

測(cè)定原理：

磷脂酶D 催化水解磷脂酰dan堿末端的磷脂酰二酯鍵生成磷脂酸和dan堿，dan堿在dan堿氧化酶催化作用下生成甜菜堿和過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在過(guò)氧化氫酶的作用下將 4-氨基安ti比林和重蒸酚氧化成粉紅色物質(zhì)，在 500nm 處有特征吸收峰。

組成：

試劑三：粉劑×1 支，-20℃避光保存。臨用前加 1ml 無(wú)水乙醇充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

自備儀器和用品：

天平、研缽、超速冷凍離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、恒溫水浴鍋、無(wú)水乙醇。

酶液提?。?/span>

組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1ml 提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于 4℃，10000g 離心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 離心 30min，棄上清，取沉淀溶于 1ml 試劑一。

細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1ml提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后于 4℃，10000g離心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 離心 30min，棄上清，取沉淀溶于 1ml 試劑一。

血清：直接測(cè)定。

測(cè)定操作：

酶活計(jì)算公式：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰dan堿產(chǎn)生 1nmol dan堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLD 活性（nmol/min /mg prot）=

A測(cè)定管 ×C 標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr÷T= 16.7× A測(cè)定管 ÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計(jì)算

A標(biāo)準(zhǔn)管

A標(biāo)準(zhǔn)管

酶活性定義：每克組織每分鐘水解磷脂酰dan堿產(chǎn)生 1nmol dan堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位

PLD 活性（nmol/min /g 鮮重）=

A測(cè)定管 ×C 標(biāo)準(zhǔn)÷W÷T = 16.7× A測(cè)定管 ÷W 

按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

A標(biāo)準(zhǔn)管

A標(biāo)準(zhǔn)管

酶活性定義：每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘水解磷脂酰dan堿產(chǎn)生 1nmol dan堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLD 活性（nmol/min /10⁴ cell）=

A測(cè)定管 ×C 標(biāo)準(zhǔn)÷細(xì)胞數(shù)量÷T = 16.7× A測(cè)定管 ÷細(xì)胞數(shù)量 

按照液體體積計(jì)算

A標(biāo)準(zhǔn)管

A標(biāo)準(zhǔn)管

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解磷脂酰dan堿產(chǎn)生 1nmol dan堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。 

PLD 活性（nmol/min /ml）=

A測(cè)定管 ×C 標(biāo)準(zhǔn)÷T=16.7× A測(cè)定管

A標(biāo)準(zhǔn)管     A標(biāo)準(zhǔn)管

C 標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，500nmol/ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g/ml；T：反應(yīng)時(shí)間，30min

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰dan堿產(chǎn)生 1nmol dan堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

 PLD 活性（nmol/min /mg prot）=

A測(cè)定管 ×C 標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr÷T= 16.7× A測(cè)定管 ÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計(jì)算

A標(biāo)準(zhǔn)管

A標(biāo)準(zhǔn)管

酶活性定義：每克組織每分鐘水解磷脂酰dan堿產(chǎn)生 1nmol dan堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

 PLD 活性（nmol/min /g 鮮重）=

A測(cè)定管 ×C 標(biāo)準(zhǔn)÷W÷T = 16.7× A測(cè)定管 ÷W

按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

A標(biāo)準(zhǔn)管

A標(biāo)準(zhǔn)管

酶活性定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘水解磷脂酰dan堿產(chǎn)生 1nmol dan堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLD 活性（nmol/min /10⁴ cell）=

A測(cè)定管 ×C 標(biāo)準(zhǔn)÷細(xì)胞數(shù)量÷T = 16.7× A測(cè)定管 ÷細(xì)胞數(shù)量按照液體體積計(jì)算

A標(biāo)準(zhǔn)管

A標(biāo)準(zhǔn)管

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解磷脂酰dan堿產(chǎn)生 1nmol dan堿所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

 PLD 活性（nmol/min /ml）=

A測(cè)定管 ×C 標(biāo)準(zhǔn)÷T=16.7× A測(cè)定管

A標(biāo)準(zhǔn)管     A標(biāo)準(zhǔn)管

C 標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，500nmol/ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g/ml；T：反應(yīng)時(shí)間，30min

注意事項(xiàng)：

顯色完成后，若有沉淀，于 8000rpm，25℃離心 5min 后取上清測(cè)定。

吸光值不宜超過(guò) 1，否則用試劑一將酶液進(jìn)行稀釋，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

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