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磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）試劑盒說明書

微量法 100T/48S

磷脂酶A2試劑盒 脂肪酸系列

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

磷脂酶A2（EC3.1.1.4）是磷脂sn-2 位脂?；饷福瑥V泛存在于動(dòng)植物組織、細(xì)菌、細(xì)胞核分泌物中，參與脂肪消化，精子成熟、細(xì)胞信號(hào)傳遞、脂質(zhì)過氧化修復(fù)、宿主反應(yīng)等生理過程，在控制體內(nèi)磷脂類物質(zhì)平衡、調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝、參與疾病的病理進(jìn)程等方面發(fā)揮著及其重要的作用。

測(cè)定原理：

磷脂酶A2 作用于 2-硫代十六酰乙基磷酸dan堿（HEPC）產(chǎn)生游離巰基，與DTNB 反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，在 412nm 處有特征吸收峰。

組成：

試劑三：液體×5 瓶，-20℃避光保存。臨用前根據(jù)用量每瓶加入 1.8ml 試劑二充分混勻；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

自備儀器和用品：

天平、超速冷凍離心機(jī)、研缽、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板。

樣品處理：

組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1ml 提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于 4℃，10000g 離心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 離心 30min，棄上清，取沉淀溶于 1ml 試劑一。

細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1ml提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后于 4℃，10000g離心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 離心 30min，棄上清，取沉淀溶于 1ml 試劑一。

血清：直接測(cè)定。

測(cè)定操作:

酶活計(jì)算公式:

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解HEPC 產(chǎn)生 1nmol 游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（?×d）×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T

= 73.53×△A÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解HEPC 產(chǎn)生 1nmol 游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/g 鮮重）= △A÷（?×d）×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T

= 73.53×△A÷W

細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘水解HEPC 產(chǎn)生 1nmol 游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/104 cell）= △A÷（?×d）×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）÷T

= 73.53×△A÷細(xì)胞數(shù)量

4 按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解HEPC 產(chǎn)生 1nmol 游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/ml）= △A÷（?×d）×V 反總÷V 樣÷T

= 73.53×△A

?：TNB 消光系數(shù)，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)總體積，1ml；V 樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.1ml；W：樣本質(zhì)量，g；V 樣總：加入提取液體積，1ml；

T：反應(yīng)時(shí)間，10min

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解HEPC 產(chǎn)生 1nmol 游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（?×d）×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T

=147.06×△A÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解HEPC 產(chǎn)生 1nmol 游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/g 鮮重）= △A÷（?×d）×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T

= 147.06×△A÷W

細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘水解HEPC 產(chǎn)生 1nmol 游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/104 cell）= △A÷（?×d）×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）÷T

=147.06×△A÷細(xì)胞數(shù)量

4 按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解HEPC 產(chǎn)生 1nmol 游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/ml）= △A÷（?×d）×V 反總÷V 樣÷T

= 147.06×△A

?：TNB 消光系數(shù)，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V 反總：反應(yīng)總體積，1ml；V 樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.1ml；W：樣本質(zhì)量，g；V 樣總：加入提取液體積，1ml；

T：反應(yīng)時(shí)間，10min

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