天冬酰an合成酶(asparagine synthetase，AS) 活性測定試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

天an酰胺合成酶是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類氨基轉(zhuǎn)移酶，催化谷an酞胺的氨基向天冬氨酸轉(zhuǎn)移。當(dāng)植物處于氨毒時天an酞胺的形成是一種解毒反應(yīng)。

測定原理：

AS 催化L-天an酰胺水解成 L-天冬an酸和氨，利用奈氏試劑檢測氨增加的速率，即可計算其酶活性。

天冬酰an合成酶活性測定試劑盒 氮代謝系列

組成：

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

臺式離心機、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、可調(diào)式移液槍、研缽、冰和雙蒸水。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 420nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣品測定（在 EP 管中加入下列試劑）：

混勻，37℃水浴 1 小時

混勻，8000 g，25℃離心 10 min；取上清液，在EP 管或 96 孔板中加入下列試劑

混勻，室溫靜置 15min，420nm 處讀取測定管和對照管吸光值，計算ΔA=A 測定管-A 對照管。對照管只要做一管。

注意：試劑六如出現(xiàn)沉淀，靜置后取上清使用。

酶活性計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.662x -0.0434；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/ml），y 為吸光值 A。 1、血清（漿）AS 活性

單位定義：每ml 血清（漿）每小時產(chǎn)生 1μg 氨定義為一個酶活力單位。

AS（μg/h/ml）＝(ΔA+0.0434) ÷0.662×V 反總÷V 樣÷T=31.722×(ΔA+0.0434)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 AS 活力的計算:

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每小時產(chǎn)生 1μg 氨定義為一個酶活力單位。

AS 活力（μg/h/mg prot）＝(ΔA+0.0434) ÷0.662×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T =31.722×(ΔA+0.0434) ÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每小時產(chǎn)生 1μg 氨定義為一個酶活力單位。

AS 活力（μg/h/g 鮮重）＝(ΔA+0.0434) ÷0.662×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T =31.722×(ΔA +0.0434) ÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每小時產(chǎn)生 1μg 氨定義為一個酶活力單位。

AS 活力（μg/h/10⁴ cell）＝(ΔA+0.0434) ÷0.662×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.0634×(ΔA+0.0434)

T：反應(yīng)時間，1h； V 反總：反應(yīng)體系總體積：0.525ml；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.025ml；V樣總：提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml； W：樣本質(zhì)量， g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)， 500 萬

b. 用 96 孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 0.3046x -0.0097；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/ml），y 為吸光值A。 1、血清（漿）AS 活力的計算:

單位的定義：每ml 血清（漿）每小時產(chǎn)生 1μg 氨定義為一個酶活力單位。

AS 活力（μg/h/ml）＝(ΔA +0.0097) ÷0.3046×V 反總÷V 樣÷T=68.94×(ΔA +0.0097)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 AS 活力的計算:

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

?

單位的定義：每mg 組織蛋白每小時產(chǎn)生 1μg 氨定義為一個酶活力單位。

AS 活力（μg/h/mg prot）＝(ΔA +0.0097) ÷0.3046×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T =68.94×(ΔA +0.0097) ÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每小時產(chǎn)生 1μg 氨定義為一個酶活力單位。

AS 活力（μg/h/g 鮮重）＝(ΔA +0.0097) ÷0.3046×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T =68.94×(ΔA +0.0097）÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每小時產(chǎn)生 1μg 氨定義為一個酶活力單位。

AS 活力（μg/h/10⁴ cell）＝(ΔA+0.0097) ÷0.3046×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.1379×(ΔA +0.0097)

T：反應(yīng)時間，1h； V 反總：反應(yīng)體系總體積：0.525ml；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.025ml；V樣總：提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml； W：樣本質(zhì)量， g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)， 500 萬。

天冬酰an合成酶活性測定試劑盒 氮代謝系列