產(chǎn)品簡介：

副流感病毒（Parainfluenza Virus）是單鏈的 RNA 病毒，四種亞型各有不同的臨床和流行病學(xué)特征。I 型和 II 型的最典型的臨床特征是造成兒童喉氣管支氣管炎，I 型是這種兒童喉氣管支氣管炎的主要原因，而 II 型次之。I 型和 II 型均能造成其它的上呼吸道和下呼吸道疾病。III 型經(jīng)常導(dǎo)致肺炎和細(xì)支氣管炎。IV型很難檢出，可能是因為它很少導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病。因此檢測副流感病毒有重要的  意義。本產(chǎn)品就是以探針法 qRT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測副流感病毒 II 型的試劑盒。

產(chǎn)品特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。

2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到 100 拷貝/反應(yīng)。

3.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)副流感病毒 II 型 RNA 高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他生物的 RNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為 5 各數(shù)量級。

6.本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法 qRT-PCR 反應(yīng)。

7.副流感病毒 2 型探針法熒光PCR試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50T/盒，可滿足一定規(guī)模的檢測需求。

檢測方法

實時熒光PCR，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點。

試劑盒成分

探針法 qRT-PCR 緩沖液、探針法 qRT-PCR酶混合液 v2、熒光 PCR 專用模板稀釋液、副流感病毒 2 型 qRT-PCR探針法引物-探針干粉、副流感病毒 2 型 qRT-PCR陽性對照(1×10E7 拷貝/μL)、使用手冊。

自備試劑

樣品 RNA，超純水，核酸純化試劑盒。

保存和運輸

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 24 個月。

使用方法：

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能

污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。如果需要 RNA 陽性樣品，需要另外訂購。

1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

7.如果有 N 個樣品，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性

對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 上步所得 4 號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次樣本制備所要求的起始樣本體積一  樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8.用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) RNA -提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的核酸-提取試劑。

三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 RT-PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 RT-PCR 陰性對照（用水做模板）， 6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個RT-PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 RT-PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 RT-PCR 陽性對照（直接用第 6 步第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)  置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好  后最后加）：

成分樣品管

N+2 個RT-PCR

陰性對照標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管

（1-6 管）

探針法 qRT-PCR 緩沖液各 10 μL10 μL各 10 μL

探針法 qRT-PCR 酶混合液 v2各 1μL1 μL各 1 μL

副流感病毒 2 型 qRT-PCR

引物-探針混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

N+2 個待測 RNA 樣本各 6 μL不加不加

超純水不加6 μL不加

第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液

（1-6 號）

不加

不加各 6μL（2 號樣

到 2 號管，3 號樣到 3 號管…）

11.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 RT-PCR：

四、數(shù)據(jù)處理

12.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須沒有讀數(shù)，或者大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于 40。對待測樣品，如果其 Ct 沒有讀數(shù)、大于或等于

40 則均為陰性，如果小于 40 則為陽性。

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