產(chǎn)品簡介：

本產(chǎn)品用于從各種動物組織（包括白細(xì)胞）快速提取總 RNA。

產(chǎn)品特點：

1.操作簡單快速，整個過程只需要不到十分鐘（對一個樣品而言）。

2.RNA 純度更高，OD260/OD280 一般在 2.0 左右。

3.一般不含用 RT-PCR 可以檢測到的基因組 DNA 污染。

4.適用于培養(yǎng)細(xì)胞、大部分動物組織和部分植物組織。

5.得到的 RNA 可直接用于 RT-PCR、Northern 雜交、cDNA 合成等實驗。

6.性價比高于進(jìn)口的柱式 RNA 提取產(chǎn)品。

7.可以進(jìn)行無氯仿操作，只是純度稍微降低，但不影響使用。

8.本產(chǎn)品足夠 50 次微量柱式提取，每次可以處理 100 mg 左右的組織。

9.動物RNA純化試劑盒（過柱法）只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份 規(guī)格包裝

動物 RNA 純化溶液 A50 mL60 mL 棕色瓶

動物 RNA 純化溶液 B25 mL30 mL 本色瓶

離心吸附柱50 套塑料袋

通用洗柱液50 mL60 mL 本色瓶

RNA 洗脫液10 mL10 mL 本色瓶

使用手冊1 份1 份

運輸及保存

常溫運輸和保存，溶液 A 需要放 4℃長期保存，有效期一年。

自備試劑

氯仿，臺式離心機

使用方法：

下面的操作步驟是針對在 1.5 mL 塑料離心管中進(jìn)行的微量提取的，如果處理樣品量大，請按比例增加各成份的用量并使用大的離心管和離心機。

1. 根據(jù)組織細(xì)胞類型的不同分為下面及種情況使用：

a)對貼壁細(xì)胞：吸盡培養(yǎng)液，在每 10 平方厘米細(xì)胞中加入 1 mL 動物 RNA 純化溶液 A，用槍輕柔吹打數(shù)次，確保細(xì)胞全部裂解并且讓基因組 DNA 充分?jǐn)嗔选?/p>

b)對懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，在每 1-5×106 懸浮細(xì)胞中加入 1 mL 動物 RNA 純化溶液 A，用槍輕柔吹打數(shù)次，確保細(xì)胞全部裂解并且讓基因組 DNA 充分?jǐn)嗔?。如果?fibroblasts 或 carcinoma cell，1 mL 溶液 A 的細(xì)胞使用量不要超過 1E6 個細(xì)胞。

c)對新鮮組織：先將剪切成小塊新鮮組織或液氮保存的組織放入 10 mL 或15 mL 塑料離心管中，每 50-100 mg 組織加 1 mL 動物RNA 純化溶液A， 用 Polytron 剪切式勻漿器勻漿 30 秒左右。對肝、脾、胰、腎等細(xì)胞分裂十分旺盛的組織（細(xì)胞中含大量正在復(fù)制的 DNA），建議組織的使用量不要超過 50 mg/ mL 動物 RNA 純化溶液 A，否則十分容易產(chǎn)生 DNA 污染。也可以用液氮研磨：在研缽中加入液氮，再加入 50-100 mg 新鮮組織， 然后研磨成粉后轉(zhuǎn)移到 1.5 mL 離心管中，再加入 1 mL 動物 RNA 純化溶液 A，震蕩 30 秒混勻。

d)  對非凍型組織 RNA 保存液或 RNAlater 等保存液保存的組織：先用紙吸去保存液后再剪切成小塊，其余操作同新鮮組織的處理。

2.如果進(jìn)行無氯仿操作（所得 RNA 純度稍低，但一般不影響后續(xù)使用），則將上步所得的細(xì)胞裂解物或勻漿液轉(zhuǎn)移至一個干凈的 1.5 mL 塑料離心管中，12,000 rpm 室溫離心 3-5 分鐘。

3.如果進(jìn)行帶氯仿操作（所得 RNA 純度比免氯仿操作稍高），則將上步所得的細(xì)胞裂解物或勻漿液轉(zhuǎn)移至一個干凈的 1.5 mL 塑料離心管中，然后加入 0.2 倍體積的自備氯仿(1 mL 動物 RNA 純化溶液 A 需 0.2 mL 氯仿)，振蕩器上充分振蕩混均 30 秒，12,000 rpm 室溫離心 3-5 分鐘。

4.將上清液轉(zhuǎn)移到一個干凈的 2 mL 塑料離心管中。注意：無氯仿操作時， 離心后管底是細(xì)胞碎片和結(jié)締組織纖維。帶氯仿操作時，離心后分上下層，  下層有機相和上下層中間含有 DNA 和蛋白質(zhì)，吸取上清時避免觸及，否則將產(chǎn)生蛋白質(zhì)和 DNA 污染。為保險起見，可以留下 100 μL 上清液不取。同時吸取上清時最好緩慢進(jìn)行。

5.加入等體積的動物 RNA 純化溶液 B，充分顛倒混勻。

6.分次（一般需要 2-3 次）將加入動物 RNA 純化溶液 B 后的混合液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，12,000 rpm 室溫離心半分鐘，棄穿透液。如果溶液粘稠，可以延長離心時間到 2 分鐘。

7.加 0.7 mL 通用洗柱液到離心吸附柱中，12,000 rpm 室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。一次洗滌一般足夠去除雜質(zhì)。

8.再加 0.3 mL 通用洗柱液到離心吸附柱中，12,000 rpm 室溫離心半分鐘，棄穿透液。此步可以省略。

9.再室溫 12,000 rmp 干甩半分鐘。此步十分重要，否則殘留的通用洗柱液會影響 RNA 的使用。

10.將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一自備的 RNase-free 1.5 mL 塑料離心管中，加入 50-100 μL RNA 洗脫液。

11.室溫 12,000 rmp 離心半分鐘，離心管中溶液即為 RNA 樣品，可以立即使用或存放于-80℃待用。

12.RNA 的電泳檢測：本試劑盒提取的 RNA 最好用甲醛變性膠電泳，如果在非變性的普通瓊脂糖膠（in TAE 或 TBE buffer）上電泳，一定要使用 RNA專用上樣液，千萬不要使用常用的 DNA 上樣液，因為 DNA 上樣液沒有經(jīng)過去 RNase 處理，也不能將 RNA 變性，得到的帶型將十分雜亂。

13.RNA 完整性的電泳檢測：如果需要做 Northern 雜交，強烈建議用戶使用甲醛變性膠進(jìn)行 RNA 電泳，因為非變性膠不能分離所有的 RNA 分子

（BioTechniques，28：414，2000）。

14.RNA 產(chǎn)量產(chǎn)率測定：將 5-10 μL RNA 溶于 TE 緩沖液中(pH 7.5-8.2 之間)檢測其在 OD260 的光吸收。通過光吸收可以得出 RNA 濃度（1 OD260 的 RNA=40 μg/mL），進(jìn)而計算出 RNA 的產(chǎn)量（濃度 X 體積)和產(chǎn)率(RNA產(chǎn)量/組織用量)。

15.RNA 純度測定：無污染的總 RNA 的 OD260/OD280 一般在 1.8

-2.1 之

間(具體數(shù)值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關(guān))，高于此范圍則分別 表示樣品可能有蛋白質(zhì)污染，但一般不影響 RT-PCR 等反應(yīng)。

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