產(chǎn)品簡介：

本產(chǎn)品是基于Feinberg 和Vogelstein 發(fā)明的隨機引物標記法而開發(fā)出來的即用型 DNA 探針標記試劑盒，標記過程由雙鏈 DNA 熱變性、隨機引物與單鏈 DNA 結(jié)合、在 Klenow DNA 聚合酶催化下，引物的延伸合成 DNA 探針并摻入標記的核苷酸三步組成，可用下面的示意圖表示：

產(chǎn)品特點：

1.提供的標記反應(yīng)液整合了除酶和模板外的所有成分，簡化了反應(yīng)加樣步驟，提高了標記反應(yīng)的可重復性。

2.使用無外切活性的 Klenow exo- DNA 聚合酶，已標記DNA 探針不會被酶降解，探針產(chǎn)量更高。

3.快速，最快 1 小時即可完成標記反應(yīng)。

4.得到的 DNA 探針比活性高（如果是同位素，可以達到 10E9 cpm/ug DNA）。

5.所需模版 DNA 量少，模板可以是線狀或環(huán)狀的、也可以是單鏈或雙鏈的，但長度必須在 100 bp 以上。

6.得到的探針長度一般在 200-400 nt 之間（如果模板長度在 1kb 以上），可以用于 Southern 雜交、Northern 雜交、原位雜交、菌落和斑點印跡雜交等。

7.本產(chǎn)品足夠 5 次標記實驗。

8.隨機引物法 DNA 探針標記試劑盒（自備標記核苷酸型）只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份  規(guī)格包裝

10×隨機引物標記反應(yīng)液10 μL0.5 mL 綠蓋管

(自備標記核苷酸型)

Klenow exo-聚合酶 5 μL0.5 mL 紅蓋管

dATP，2 mM 10μL0.5 mL 白蓋管

dTTP，2 mM 10μL0.5 mL 紫蓋管

dGTP，2 mM 10μL0.5 mL 藍蓋管

dCTP，2 mM 10μL0.5 mL 黃蓋管

標記專用隨機引物溶液 10μL0.5 mL 橙蓋管

超純水 1 mL1.5 mL 本色管

使用手冊 1 份無

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

0.5 M EDTA（pH 8.0），需要自備標記的核苷酸。

使用方法：

注意：隨機引物標記效率跟起始模板量和保溫時間相關(guān)，雜交時需要探針 DNA 必須達到一定的濃度，其中探針/模板比越高，沒有標記的模板 DNA 對雜交的競爭性抑制越低。用戶在實驗前可以根據(jù)下表選擇合適的起始模板量和保溫時間：

1. 在一干凈的硅化的塑料離心管中加入下列成分：

成分用量

模板 DNA50-150 ng

隨機引物2 μL

10×隨機引物標記反應(yīng)液2 μL

超純水補水到 15 μL

注意：非同位素標記基團（如生物-素和地-高辛）疏水性強，易與塑料離心管表面非特異性結(jié)合，所以要硅化塑料離心管。模板 DNA 并非越多越好，否則沒有標記的模板 DNA 在雜交時會競爭性地抑制標記 DNA 跟靶分子的雜交，反而降低雜交信號強度。

2.沸水浴 10 分鐘，或在PCR 儀上 100℃加熱 10 分鐘徹-底變性模板 DNA，結(jié)束后需要立即放冰上待用。不能緩慢降溫，否則變性的模板 DNA 單鏈又會雜交形成雙鏈。

3.離心數(shù)秒使所有液體集中在管底，如果標記物為 dTTP 則加入除 dTTP 之外的三種核苷酸（dATP、dGTP、dCTP）各 1 μL（共 3 μL，濃度均為 2mM），自備的 dTTP/標記dUTP 混合物 1μL，最后加入 1 μL Klenow exo 聚合酶。如果標記物為 dCTP 則加入除 dCTP 之外的三種核苷酸（dATP、dGTP、dTTP）各 1 μL，以此類推。

注：dTTP/標記 dUTP 混合物中dTTP 和標記 dUTP 的總濃度必須達到2mM， dTTP 與生物-素標記dUTP 或地-高辛標記的 dUTP 的比例在 65：35 為最佳。但如果使用自備的其他標記核苷酸，如 fluorescein、hydroxycoumarin、 resorufin 和 aminoallyl 標記的 dUTP，則用戶需要自己摸索其與 dTTP 之間的最佳比例，如果使用 32P 標記的dUTP，則比活最好為 3000Ci/mmol，濃度為好為 10uCi/μL，并且不需要加入 dTTP。

4.輕柔吹打混勻。如有液滴沾在管壁上，離心數(shù)秒使所有液體集中在管底。

5.37℃保溫 1-20 小時。反應(yīng)結(jié)束后加熱 100℃ 5 分鐘使 DNA 聚合酶變性， 同時使 DNA 探針變性成單鏈，然后立即冰上冷凍。不能緩慢降溫，否則變性的模板 DNA 單鏈又會雜交形成雙鏈。

6.變性后的標記反應(yīng)液可以放-20℃長期保存，也可以直接加入到雜交反應(yīng)液中進行雜交。如果電泳檢測，標記產(chǎn)物將是彌散狀態(tài)。

注意：本方法標記核苷酸摻入率極-高，因此可以不經(jīng)純化直接使用。如果需要純化， 不要用酚抽提法純化非同位素標記的 DNA 探針，因為這些標記分子（如生物-素或地-高辛等）疏水性強，能使標記的 DNA 進入疏水的有機相而丟失。只能選擇乙醇直接沉淀或 Sephadex G50 過柱回收（需另購柱式探針純化試劑盒）。對比活高

的同位素標記探針，由于同位素其極其不穩(wěn)定，因此應(yīng)該立即使用，不要長久放置。

選擇我們的隨機引物法 DNA 探針標記試劑盒（自備標記核苷酸型），就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！