產(chǎn)品簡介：

菌落 PCR 是篩選重組子的有效方法，可以使質(zhì)粒鑒定過程從兩天縮短到幾小時(shí)。但如果宿主是酵母，其菌落 PCR 的難點(diǎn)則是破壁，因?yàn)榻湍傅募?xì)胞壁比細(xì)菌堅(jiān)韌許多。本產(chǎn)品是基于玻璃珠破壁方法而開發(fā)的酵母菌落 PCR 產(chǎn)品。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.破壁效率高，甚至可以用于野生型酵母。

2.既可用酵母菌落，也可用酵母培養(yǎng)液。

3.條件溫和，菌落 PCR 可以擴(kuò)增長達(dá) 3 kb 的 DNA。

4.既可小規(guī)模篩選，也適用于大規(guī)模篩查。

5.高靈敏度，既可用于擴(kuò)增酵母質(zhì)粒，也可以用于擴(kuò)增酵母基因組 DNA。

6.PCR 反應(yīng)液中含有惰性電泳染料，反應(yīng)后可直接上樣電泳，不需另加上樣液。

7.處理過的酵母菌落樣品低溫長期保存后仍能用于 PCR 篩查。

8.酵母菌落PCR試劑盒足夠 100 次 60 μL 體系的酵母菌落 PCR（細(xì)菌菌落 PCR 需要用另一款產(chǎn)品）。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份 規(guī)格包裝

酵母破壁液 2×1 mL1.5 mL 綠蓋管

2×PCR MasterMix

（菌落篩選專用） 2×1.5 mL1.5 mL 紅蓋管

酸洗玻璃珠400-600 μm 3 g2.0 mL 本色管

使用手冊 1 份1 份

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為一年。

自備試劑

酵母菌落，模版專一性引物，TE 緩沖液。

使用方法：

一、 酵母破壁

1.如果有 N 個(gè)樣本，則標(biāo)記 N+2 個(gè) 1.5 mL 的塑料離心管，N 個(gè)用于樣本， 一個(gè)用于陽性對照 PC（Positive Control，確認(rèn)有質(zhì)粒陽性的樣本），一個(gè)用于陰性對照 NC（Negative Control，可以用水代替）。

2.在每個(gè)管中加入 20 μL 酵母破壁液。

3.挑入一個(gè)新鮮酵母菌落（芝麻大小即可）或 2 μL 酵母飽和菌液。

4.加入體積跟酵母破壁液相當(dāng)?shù)乃嵯床Ａе椋ㄖ亓吭?20-30 mg）。

5.渦旋震蕩 3 分鐘。

6.常溫 10000 rpm 離心半分鐘后可以直接取上清作為模板立即進(jìn)行 PCR。如果不立即進(jìn)行PCR，需將上清全部轉(zhuǎn)移到新離心管中（至少可以取出 15 μL），再加入等體積的自備 TE 緩沖液，放-20℃待用。TE 緩沖液中的 EDTA 可以抑制樣本中殘留 DNase 的活性，可以使 DNA 的放置時(shí)間更長。

二、PCR 擴(kuò)增

7. 在一個(gè) 1.5 mL 的預(yù)冷塑料離心管中分別加入下列預(yù)冷成份并充分混勻 ， 得到 PCR 預(yù)混液并放冰上待用。由于有 N+2 個(gè)樣本，所以配制時(shí)多加一個(gè)， 按 N+3 計(jì)算：

7.將上步得到的預(yù)冷 PCR 預(yù)混液按 59 μL/管分裝到 N+2 個(gè)標(biāo)記并且預(yù)冷的 PCR 管中。

8.將第 6 步制備的N+2 個(gè)樣品各取 1 μL 加入上步加有 59 μL 混合液的 PCR管中。PC 樣到 PC 管，NC 樣到 NC 管，1 號樣品加入到 1 號 PCR 管中，以此類推。由于裂解液含大量 PCR 抑制物，樣本用量不要超過 1.5 μL，否則樣本加得越多，PCR 越容易被抑制。

9.將 N+2 個(gè)預(yù)冷的 PCR 管快速放入 PCR 儀器中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 溫度參數(shù)根據(jù)引物和模板情況由客戶自己預(yù)先確定。

10.PCR 結(jié)束后直接取 10 μL 電泳直接進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。本試劑盒提供的 PCR MasterMix（菌落篩選專用）中已經(jīng)含有電泳示蹤劑和促沉劑，故可以直接上樣。橙黃色電泳染料的泳動(dòng)速度對應(yīng)于 50 bp 的 DNA，藍(lán)色電泳染料的泳動(dòng)速度對應(yīng)于 3-5 kb 的 DNA。

11.如果陰性對照 NC 有預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，則無論陽性對照 PC 和 N 個(gè)樣本的結(jié)果如何，整個(gè)實(shí)驗(yàn)無效。說明環(huán)境污染，需要解決污染問題再繼續(xù)。  如果陽性對照 PC 沒有預(yù)期大小的片段，且沒有任何樣本呈現(xiàn)陽性，則很可能是試劑、程序、引物、儀器等有問題，需要解決問題后再繼續(xù)。如果有任 何一個(gè)樣本呈現(xiàn)陽性（不包括陰性對照），則實(shí)驗(yàn)有效，可以繼續(xù)分析每個(gè)樣  品。

12.如果陽性對照有預(yù)期大小的片段，陰性對照沒有，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)有效?？梢苑治雒總€(gè)樣品。每個(gè)樣品如果有預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，則初步判斷為陽性。  如果沒有，則判斷為陰性。

13.對陰性樣本，可以用超純水將其稀釋 10 倍、百倍、千倍、萬倍 4 個(gè)稀釋度， 然后一起再進(jìn)行 PCR 檢測，如果某個(gè)稀釋度的樣本出現(xiàn)預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物，則測試時(shí)需要先將樣本稀釋到該稀釋度后再測。

14.可以將陽性樣品對應(yīng)的菌落再挑出來進(jìn)行培養(yǎng)并進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

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