產(chǎn)品簡介：

本試劑盒提供合成 cDNA 第一鏈（逆轉(zhuǎn)錄）所需要的全部試劑。其原理是用突變的莫洛尼氏鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶（M-MuLV RT）以 RNA 為模板，高效合成 cDNA。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.使用突變的反轉(zhuǎn)錄酶，內(nèi)源 RNase H 活性低，使得在逆轉(zhuǎn)錄過程中 RNA 模板不容易被降解，得到的 cDNA 平均長度更長。

2.最長可合成 13 Kb 的 cDNA。

3.可以使用 oligo-dT、隨機(jī)引物和 RNA 專一性引物三種引物（前兩種本試劑盒提供）。

4.總 RNA、poly(A)+RNA 或特殊 RNA 均可作為模板。

5.得到的 cDNA 可用于后續(xù)的 cDNA 文庫構(gòu)建、RT-PCR、探針標(biāo)記等。

6.本產(chǎn)品足夠 50 次 20 ?L 體系的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

7.逆轉(zhuǎn)錄試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50次

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

無

使用方法：

一：合成 PCR 用的 1st-strand cDNA

1. 在一干凈的反應(yīng)管中加入RNA 模板。注意：RNA 模板不能含有基因組 DNA 污

染。

RNA 模板種類加入量

總 RNA100-500 ng

或 poly(A) mRNA10-500 ng

 或?qū)Ｒ坏?RNA

2.加入引物和水

0.01 pg-500 ng

引物種類加入量

Oligo (dT)12-18，0.5 ?g/?L1 ?L

或隨機(jī)引物(6 堿基，無-修飾)，

0.2 ?g/?L1 ?L

或 RNA 模板專一性引物15-20 pmol

注意：隨機(jī)引物與 RNA 模板的比例跟 cDNA 合成的平

均長度成反比。

3.加水到 13 ?L 。

4.70℃保溫 5 分鐘后立即冰浴，此步可以打開 RNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

5.再加入 5 ?L 4×RT Buffer（含 dNTP）。

6.37℃保溫 5 分鐘。對(duì)富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的高 GC RNA 模板，可以改成 45℃保溫 5 分鐘。但如果使用隨機(jī)引物，由于其很短，則改成 25℃ 5 分鐘以便其跟RNA 結(jié)合。

7.加入 1 ?L MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI），反應(yīng)終體積為 20 ?L。

8.42℃保溫 60 分鐘。但如果使用隨機(jī)引物，需要先 25℃保溫 10 分鐘，待合成了一段 cDNA 后，然后再轉(zhuǎn)移到 42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應(yīng)。

9.70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為PCR 模板使用，不需要純化。

二：合成建文庫用的 1st-strand cDNA

1.在一干凈的反應(yīng)管中加入RNA 模板。注意：RNA 模板不能含有基因組 DNA 污染。

2.加入引物

引物種類加入量

Oligo (dT)12-18，0.5 ?g/?L1 ?L

或隨機(jī)引物(6 堿基，無-修飾)

0.2 ?g/?L1 ?L

或 RNA 模板專一性引物100 pmol

注意：隨機(jī)引物與 RNA 模板的比例跟 cDNA 合成的平均長度成反比。

3.加水到 13 ?L。

4.70℃保溫 5 分鐘后立即冰浴，此步可以打開 RNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

5.再加入 5 ?L 4×RT Buffer（含 dNTP）。

6.37℃保溫 5 分鐘。對(duì)富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的高 GC RNA 模板，可以改成 45℃保溫 5

分鐘。如果使用隨機(jī)引物，則改成 25℃ 5 分鐘。

7.加入 2 ?L MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI），反應(yīng)終體積為 20 ?L。

8.42℃保溫 60 分鐘，但如果使用隨機(jī)引物，需要先 25℃保溫 10 分鐘，然后再轉(zhuǎn)移到 42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應(yīng)。

9.70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以用于第二鏈 cDNA 的合成或放置在-20℃長期保存。

選擇我們的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航！