產(chǎn)品簡介：

確定基因的轉(zhuǎn)錄起始位點和終止位點是研究基因結(jié)構(gòu)和功能的最重要工作之一，最-通用的方法是 Frohman 發(fā)明 Rapid Amplification of cDNA Ends。其用于確定轉(zhuǎn)錄起始位點的方法叫 5′RACE 法，用于確定轉(zhuǎn)錄終點的方法叫 3′RACE 法。它們是通過 PCR 快速克隆 cDNA 末端，在不建立 cDNA 文庫的前提下，利用已知 cDNA 序列設(shè)計引物，通過向 mRNA 兩端延伸和擴增獲得兩個末端的序列。本試劑盒就是根據(jù) RACE 技術(shù)改良后開發(fā)的確定mRNA 3′末端的試劑盒。

產(chǎn)品特點：

1.即開即用，客戶只需要準備總 RNA（或 mRNA）和專一性引物。

2.反應(yīng)條件經(jīng)過精心優(yōu)化，不需要用戶辛苦摸索條件。

3.本產(chǎn)品足夠 10 次 3′RACE 實驗。

4.改良 3′RACE 試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

成分規(guī)格包裝

MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶-RI 混合液20 μL0.5 mL 紅蓋管

MMLV Buffer-dNTP 混合液50 μL0.5 mL 綠蓋管

2×PCR MasterMix1 mL×22.0 mL 本色蓋

3′RACE 引物 A 干粉10 次0.5 mL 黃蓋管

3′RACE 引物 B 干粉10 次0.5 mL 紫蓋管

3′RACE 引物 C 干粉10 次0.5 mL 白蓋管

RNase-Free 水1 mL2.0 mL 黃蓋管

使用手冊1 份無

運輸及保存

mRNA（或總 RNA）、基因?qū)Ｒ恍砸?A、基因?qū)Ｒ恍砸顱、超純水。

自備試劑

低溫運輸、-20℃保存、有效期一年。

使用方法：

一：引物的設(shè)計和準備工作

利用已知道序列的區(qū)域設(shè)計基因?qū)Ｒ恍砸飪蓷l（A、B），其中引物 B 和引物 A 比較，靠 3′端 10-30 個堿基，類似巢式 PCR 的引物設(shè)計?；?qū)Ｒ恍砸锏?Tm 最好跟 3′RACE 引物B 和引物 C 的一致，即 Tm 為 58℃。引物合成后加超純水使其濃度為 10 μM，放冰上待用。

二：利用含 Oligo(dT)的 3′RACE 引物 A 進行逆轉(zhuǎn)錄

注意：MMLV 酶使用前必須短暫離心，因為它含 50%甘油，及其粘稠，否則將取不到所需體積。如果可能，最好使用Poly(A)RNA 作為模板。

1.在一個 PCR 管中，加入以下組分：

成分用量

mRNA（或總RNA）0.2-2 μg（5 μg） 3′RACE引物A（10μM）1 μL

MMLV Buffer-dNTP混合液5 μL

RNase-Free水補至19 μL 合計18 μL

2.65℃保溫 5 分鐘,展開 RNA 的二級結(jié)構(gòu)，立即冰浴待用。

3.在冰浴的PCR 管中加入 2 μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶-RI 混合物。

4.先 37℃保溫 60 分鐘，再 42℃保溫 30 分鐘進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最后 50℃保溫 10 分鐘終止反應(yīng)。

5.加入 0.5 mL RNase-free 水稀釋上步得到的 cDNA，冰浴待用。長期放置需要放-20℃保存。

三：利用基因?qū)Ｒ恍砸顰 和試劑盒提供的 3′RACE 引物 B 進行第一輪PCR

6.用不同模板用量進行 4 個 RT 反應(yīng)液（即稀釋后的cDNA 模板）設(shè)置PCR，樣品組需要設(shè)置模板用量梯度，單位：μL。

成分梯度1梯度2梯度3梯度4

稀釋后的 cDNA0 μL1 μL5 μL15 μL

自備基因?qū)Ｒ恍砸?A（10μM）2.5 μL2.5 μL2.5 μL2.5 μL

3′RACE 引物 B（10 μM）2.5 μL2.5μL2.5μL2.5μL

98℃ 5 分變性 RNA-cDNA 雜交鏈，短暫離心后再加入下列成分

2×PCR MasterMix25 μL25 μL25 μL25 μL

RNase-free 水20 μL19 μL15 μL5 μL

合計50 μL50 μL50 μL50 μL

7.按下列參數(shù)進行 cDNA 第二鏈的合成和PCR：

第 1 步，cDNA 第二鏈的合成：52-60℃ 2 分，72℃ 40 分（此步的目地是合成第二鏈的 cDNA，復(fù)性溫度需要根據(jù)自備基因?qū)Ｒ恍砸?A 的 Tm 值決定，一般可以從 55℃開始）。

第二步 PCR 循環(huán) 30 次：94℃ 1 分鐘，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分，循環(huán) 30 次后， 最后 72℃延伸 15 分。PCR 擴增的復(fù)性溫度需要根據(jù)自備基因?qū)Ｒ恍砸顰 的 Tm 值決定，一般可以從 55℃開始。

8.取 5 μL PCR 反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳以確認PCR 擴增產(chǎn)物。若得到目的擴增產(chǎn)物需要用于后續(xù)實驗，請于-20℃保存；若沒有得到目的擴增產(chǎn)物，可按下列步驟進行巢式 PCR 反應(yīng)。

四：利用基因?qū)Ｒ恍砸顱 和試劑盒提供的 3′RACE 引物 C 進行巢式PCR 反應(yīng)

9.將上輪 PCR 產(chǎn)物（4 管）用水稀釋約 20 倍（在 50 μL PCR 反應(yīng)液中加入 1 mL

自備的超純水），然后分別作為模板進行巢式 PCR 擴增。PCR 反應(yīng)設(shè)置如下：

成分1-4管

2×PCR MasterMix各 25 μL 上步得到的 PCR 反應(yīng)液（稀釋 20 倍后）4 種之一 1 μL

自備的基因?qū)Ｒ恍砸?B（10 μM）2.5 μL 試劑盒提供的 3′RACE 引物 C（10 μM）2.5 μL

超純水補至 50 μL

10.PCR 反應(yīng)。按下列條件進行 PCR：

第 1-30 次循環(huán)：94℃ 1 分鐘，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分（復(fù)性溫度需要根據(jù)自備基因?qū)Ｒ恍砸?B 的 Tm 值進行優(yōu)化，一般可以從 55℃開始）。最后延伸：72℃ 15 分鐘。

11.電泳檢測。然后根據(jù)實驗結(jié)果進行切膠回收并 TA 克隆，選 5-10 個單菌落進行測序。

選擇我們的改良 3′RACE 試劑盒，就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！