產(chǎn)品簡介：

eccDNA 就是 extrachromosomal circular DNA（染色體外環(huán)狀 DNA）的簡稱，它們是從正?；蚪M中分離或脫落下來，游離于染色體基因組之外的環(huán)狀 DNA。長度主要分布在 0.1-5Kb 之間，99%小于 25Kb。近年來研究表明，eccDNA 普遍存在于包括酵母在內(nèi)得真核細(xì)胞中，因此其進(jìn)行深入研究具有重要的意義。但是純化 eccDNA，尤其是測序級的 eccDNA 一直是個(gè)難題，為此本公司開發(fā)了本產(chǎn)品。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開即用，直接用培養(yǎng)的酵母細(xì)胞為起始材料，最后得到純化的 eccDNA， 用戶不需要自己配制各種溶液，優(yōu)化各種條件。

2.基于沉淀法，不用過柱法和磁珠法，減少短的 eccDNA 的丟失。

3.含專門的酶切消化線狀 DNA 的步驟，降低線狀 DNA 的干擾。

4.本產(chǎn)品含熒光染料法滾環(huán)擴(kuò)增試劑盒，進(jìn)一步富集 eccDNA。

5.本產(chǎn)品一次可以處理約 5×10E8 個(gè)培養(yǎng)的酵母細(xì)胞。

6.本產(chǎn)品足夠 25 次 eccDNA 的純化和擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

7.酵母 eccDNA 純化及擴(kuò)增試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

名稱規(guī)格包裝

酵母 eccDNA 純化溶液 A250mL250mL 本色瓶

酵母 eccDNA 純化溶液 B250mL250mL 本色瓶

酵母 eccDNA 純化溶液 C250mL250mL 本色瓶

酵母 eccDNA 純化溶液 D250mL250mL 棕色玻璃瓶

酵母 eccDNA 純化溶液 E250mL×2250mL 本色瓶

酸洗玻璃珠（直徑 800um）10g10mL 本色瓶

線狀 DNA 消化緩沖液1.5mL1.5mL 綠蓋管

線狀 DNA 消化酶15uL0.5mL 紅蓋管

環(huán)狀 DNA RCA 試劑盒25 次/1 套五孔盒

使用手冊1 份無

運(yùn)輸及保存

常溫運(yùn)輸和保存，但三個(gè)低溫成分：線狀 DNA 消化緩沖液、線狀 DNA 消化酶

和環(huán)狀 DNA RCA 試劑盒需要低溫運(yùn)輸和-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

75%乙醇，超純水

使用方法：

一：eccDNA 粗提（粗體液中含有線狀 DNA，線粒體 DNA 和 eccDNA）

1.培養(yǎng)酵母細(xì)胞：按常規(guī)方法離心沉淀 5×10E6 個(gè)酵母細(xì)胞。

2.加入 10mL 酵母 eccDNA 提取溶液 A 后重懸細(xì)胞，加入玻璃珠（800nm）0.1g，渦旋震蕩 3 分鐘。

3.加入 10mL 酵母 eccDNA 提取溶液 B，輕柔顛倒 10 次。

4.加入 10mL 酵母 eccDNA 提取溶液 C，輕柔顛倒 10 次。

5.常溫離心 7500g 10 分鐘，此步將沉淀下大部分染色體 DNA 和蛋白質(zhì)。

6.將上清液體轉(zhuǎn)移到新的 10mL 離心管中。

7.加入等體積的酵母 eccDNA 提取溶液 D，渦旋震蕩 3 分鐘。

8.常溫離心 7500g 5 分鐘，蛋白質(zhì)將在兩相中間形成白膜。小心將含 DNA 的上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。

9.重復(fù)第 11-12 步一次。

10.常溫離心 7500g 5 分鐘，殘留蛋白質(zhì)將在兩相中間形成白膜。小心將含 DNA 的上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。

11.加入 2 倍體積的酵母 eccDNA 提取溶液 E，顛倒混勻后，常溫離心 7500g 10 分鐘。

12.加入自備的 10mL 75%乙醇，顛倒混勻后，常溫離心 7500g 3 分鐘。

13.吸棄上清后，再短暫離心，再吸棄上清。沉淀即含有酵母 eccDNA 的粗提物。

14.開蓋短暫放置在室溫 3 分鐘。

15.加入 50uL 1×線狀 DNA 消化緩沖液，再加入 1uL 線狀 DNA 消化酶，輕柔吹打混勻。

16.37C 保溫 2 小時(shí)。

17.加入酵母 eccDNA 提取溶液 D，充分渦旋震蕩混勻。

18.常溫離心 7500g 5 分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。

19.加入 2 倍體積的酵母 eccDNA 提取溶液 E，顛倒混勻。

20.常溫離心 4500g 10 分鐘。

21.加入 10mL 75%乙醇，顛倒混勻后，常溫離心 4500g 3 分鐘。

22.吸棄上清，短暫離心，再吸棄上清。

23.加入 20uL 超純水，吹打溶解酵母 eccDNA 沉淀。由于有助沉劑，所以沉淀可見。

24.取 5uL 進(jìn)行 RCA 擴(kuò)增，剩余的放-20℃長期保存。

25.RCA 擴(kuò)增：在兩個(gè) PCR 管中，分別加入加入 5uL eccDNA 模板（樣品管）

和 5uL 超純水（陰性對照管），再分別加 10uL 2×RCA 擴(kuò)增液，2uL 20×隨機(jī)引物 V2.0，2uL 超純水，共 19uL。 95℃ 5 分鐘變性，立即放冰上，再分別加入 1uL 的phi39 DNA 聚合酶，30℃保溫 16 小時(shí)。如果使用熒光定量 PCR儀保溫，則設(shè)置每 10 分鐘一個(gè)循環(huán)，溫度 30℃，每次循環(huán)采集一次 SYBR 通道的熒光信號(hào)。樣本管應(yīng)該有標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增曲線，而陰性對照管將沒有擴(kuò)增  曲線。

26.  70℃10 分鐘變性滅活酶，所得擴(kuò)增后的 DNA 可以用于各種后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

選擇我們的酵母 eccDNA 純化及擴(kuò)增試劑盒，就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航！