目錄:上海烜雅生物科技有限公司>>分子生物學(xué)試劑>>試劑盒>> GST 標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化試劑盒
供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 20次 |
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貨號 | XY-D-1843 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
主要用途 | 科研 | 英文名稱 | GST Tagged Protein Micropurification Kit |
保存條件 | -20℃ | 有效期 | 1年 |
產(chǎn)品簡介:
重組蛋白 N 端的 GST(谷胱-甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶,Glutathione S Transferase)能提高重組蛋白的水溶性,所以常用于蛋白質(zhì)重組表達(dá)。GST-谷胱-甘肽親和層析是利用 GST 標(biāo)記的蛋白能與谷胱-甘肽層析介質(zhì)結(jié)合,并能被還原型谷胱-甘肽洗脫的特點而建立,是目前分離純 化 GST 標(biāo)記蛋白質(zhì)的重要方法。
產(chǎn)品特點:
1.一站式套裝,含所需的谷胱-甘肽介質(zhì)、溶液和層析柱,用戶只需要提供表達(dá) GST 標(biāo)記蛋白的細(xì)菌(酵母、桿狀病毒、培養(yǎng)細(xì)胞)即可,非常方便。
2.專一性強,一次過柱即可獲得純度高達(dá) 95%的 GST-標(biāo)記蛋白。
3.只能在非變性條件下使用,只可用于純化沒形成包涵體的 GST 標(biāo)記蛋白。
4.每次可以處理 20 mL 的表達(dá)菌液,適合初步篩選和鑒定。
5.提供 4 mL 濃度為 50%的谷胱-甘肽-Agarose 溶液,可吸附 5-10 mg GST 標(biāo)記蛋白質(zhì)。
6.本介質(zhì)可以反復(fù)使用多次。
產(chǎn)品參數(shù):
成分規(guī)格包裝
谷胱-甘肽-瓊脂糖溶液,50%4 mL5 mL 本色瓶
10×PBS 緩沖液100 mL125 mL本色瓶
GST 標(biāo)簽蛋白純化溶液 A1 mL1.5 mL 藍(lán)蓋管
GST 洗脫緩沖液成分一25 mL30 mL 本色瓶
GST 洗脫緩沖液成分二80 mg0.5 mL 棕色管
溶-菌酶,20 KU/mg30 mg0.5 mL 棕色管
Benzonase 溶液,1 U/?L100 ?L0.5 mL 紅蓋管
PMSF 溶液,10 mg/mL1 mL1.5 mL 白蓋管
6 mL 層析柱(帶篩板)1 套塑料袋
使用手冊1 份1 份
運輸及保存
GST 標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化試劑盒常溫運輸和保存,谷胱-甘肽-瓊脂糖溶液,GST 洗脫緩沖液成分二,溶菌-酶,20 KU/mg 需常溫運輸 4℃保存,Benzonase 溶液,1 U/?L 和 PMSF 溶液,10 mg/mL 需低溫運輸,-20℃保存。有效期一年
自備試劑
超純水
使用方法:
一:重組蛋白的表達(dá)和細(xì)菌收集
1.37℃振蕩培養(yǎng) 20 mL 含表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)菌到 OD600=0.6-0.8。
2.加 IPTG 到終濃度為 0.1 mM,30℃振蕩培養(yǎng) 3 小時或 22℃振蕩培養(yǎng) 8 小時(或過夜)。
3.4℃ 5000×g 離心 10 分鐘收集 20 mL 表達(dá)菌液,棄上清。
4.用 1×PBS 緩沖液重懸細(xì)菌沉淀,4℃ 5000 g 離心 10 分鐘,棄上清。沉淀可直接用于裂解或放-80℃保存。1×PBS 緩沖液可用自備的超純水稀釋本試劑盒提供的 10×
PBS 緩沖液而得。PBS 緩沖液極其容易長細(xì)菌,注意防止污染。
二:細(xì)胞裂解
5.如果用超聲波破碎細(xì)胞,先用 1 mL 冰浴的新鮮配制的細(xì)胞裂解液重懸細(xì)菌沉淀(細(xì)胞
裂解液的配制方法:在 1 mL 1×PBS 緩沖液中加入 50 ?L 溶液A 和 50 ?L 10 mg/mL 的 PMSF 溶液,混勻即可)。冰上超聲裂解重懸菌體直到在顯微鏡下看見絕大多數(shù)細(xì)胞破裂。超聲參數(shù)需根據(jù)儀器型號自行摸索,一般選 1K-10K 頻率處理 15 次,每次 20
秒,間隔 1 分鐘(必需放置在冰上)。裂解物不能粘稠,否則會堵塞層析柱。
6.如果用酶法破裂細(xì)胞,則在 1 mL 冰浴的、新鮮配制的細(xì)胞裂解液重懸細(xì)菌(細(xì)胞裂解液配制方法:在 1 mL 1×PBS 緩沖液中加入 1.5 mg 溶菌-酶干粉、50 ?L10 mg/mL 的 PMSF 溶液和 5 ?L Benzonase 溶液,混勻即可)。將重懸細(xì)菌冰上放置 30 分鐘, 得到細(xì)菌裂解物。
7.將超聲或酶法得到的細(xì)胞裂解物在 13000×g 4℃離心 10 分鐘去除未裂解細(xì)胞和裂解細(xì)胞碎片以防堵柱,所得上清即含可溶性 GST 標(biāo)記蛋白。預(yù)留少量(如 100 ?L)作為裂解液留樣,其余用于第 10 步的過柱。
三:層析柱的制備和 GST 蛋白純化
8.搖晃將 4 mL 谷胱-甘肽-瓊脂糖介質(zhì)充分混勻后,全部加入到預(yù)放了一片篩板的層析柱中
(介質(zhì)的最-低用量需要根據(jù) GST 蛋白產(chǎn)量決定,100 mL 菌液最少需要使用 200 ?L 介質(zhì)。此處加 2 mL 則綽綽有余)。下列步驟各溶液的用量均針對 4 mL 介質(zhì)而定,如果介質(zhì)用量不同,各溶液用量需相應(yīng)調(diào)整。
9.用 40 mL 預(yù)冷的 1×PBS 緩沖液洗柱。
10.將第 7 步得到的上清液(含可溶性 GST 標(biāo)記蛋白)上柱,讓重力使上柱液自然流出, 收集并保存穿透液用于 SDS-PAGE 電泳。GST 和谷胱-甘肽之間的結(jié)合很緩慢,所以流速一定不能快,否則結(jié)合不充分。流速一般在 0.2-1 mL/分鐘即可。如要提高 GST 標(biāo)記蛋白與介質(zhì)的結(jié)合效率,可用本試劑盒提供的紅蓋將層析柱下的漏液口堵上,讓細(xì)菌 裂解液和介質(zhì)在 4℃結(jié)合 30 分鐘或過夜。也可以將穿透液反復(fù)上柱。
11.用 10 mL 1×PBS 緩沖液洗柱,收集并保存穿透液(含雜蛋白)并預(yù)留100 ?L 作為穿透液留樣,其余在確認(rèn)實驗成功后再丟棄。
12.用 0.2-0.5 mL GST 洗脫液洗柱,收集并保存穿透液,此穿透液即純化的 GST 標(biāo)記蛋白樣品。GST 洗脫液的配制方法是將約 80 mg GST 洗脫液成分二干粉全部加入到GST 洗脫液成分一溶液中,搖晃直到干粉全部溶解即得 GST 洗脫液,分裝成小份放-20℃保存,每次用一管。由于它可能含蛋白酶污染,所以純化樣品不能在 4℃長期放置,需留100 ?L 左右用于后續(xù)濃度測定或/和 SDS-PAGE 電泳,其余放-80℃長期放置。
13. 用裂解液留樣(第 7 步)、穿透液留樣(第 11 步)和純化樣品留樣(第 12 步)進行蛋白定量或/和 SDS-PAGE 分析。注意:本操作沒有預(yù)先脫鹽,故只能用 Bradford 法或 OD 檢測法測定裂解液留樣、穿透液留樣和樣品留樣的蛋白濃度。按 OD 檢測法,1 OD280 約等于 0.5 mg/mL 蛋白。由于 GST 的分子量為 26 KD,所以在 SDS-PAGE 膠上,GST 標(biāo)記蛋白將比天然蛋白大 26 KD。
附:GST 柱的恢復(fù)(本試劑盒不含所需試劑)
1.用 3 倍介質(zhì)體積的 6 M 鹽酸胍處理柱子 10 分鐘。介質(zhì)為 2 mL 則用 6 mL,下同。
2.用 3 倍介質(zhì)體積的超純水處理柱子 10 分鐘。
3.用 3 倍介質(zhì)體積的緩沖液一(0.5 M NaCl,0.1 M TrisHCl,pH 8.5)處理柱子 10分鐘;用 3 倍介質(zhì)體積的緩沖液二(0.5 M NaCl,0.1 M TrisHCl,pH 4.5)處理柱子 10 分鐘。此步驟重復(fù)兩次。
4.用 3 倍介質(zhì)體積的超純水處理柱子 3 次。
5.若需要立即使用,則用 3 倍介質(zhì)體積的 1×PBS 緩沖液處理柱子 2 次。
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