產(chǎn)品簡介：

重組蛋白 N 端的 GST（谷胱-甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶，Glutathione S Transferase）能提高重組蛋白的水溶性，所以常用于蛋白質(zhì)重組表達(dá)。GST-谷胱-甘肽親和層析是利用 GST 標(biāo)記的蛋白能與谷胱-甘肽層析介質(zhì)結(jié)合，并能被還原型谷胱-甘肽洗脫的特點而建立，是目前分離純   化 GST 標(biāo)記蛋白質(zhì)的重要方法。

產(chǎn)品特點：

1.一站式套裝，含所需的谷胱-甘肽介質(zhì)、溶液和層析柱，用戶只需要提供表達(dá) GST 標(biāo)記蛋白的細(xì)菌（酵母、桿狀病毒、培養(yǎng)細(xì)胞）即可，非常方便。

2.專一性強，一次過柱即可獲得純度高達(dá) 95%的 GST-標(biāo)記蛋白。

3.只能在非變性條件下使用，只可用于純化沒形成包涵體的 GST 標(biāo)記蛋白。

4.每次可以處理 20 mL 的表達(dá)菌液，適合初步篩選和鑒定。

5.提供 4 mL 濃度為 50%的谷胱-甘肽-Agarose 溶液，可吸附 5-10 mg GST 標(biāo)記蛋白質(zhì)。

6.本介質(zhì)可以反復(fù)使用多次。

產(chǎn)品參數(shù)：

成分規(guī)格包裝

谷胱-甘肽-瓊脂糖溶液，50%4 mL5 mL 本色瓶

10×PBS 緩沖液100 mL125 mL本色瓶

GST 標(biāo)簽蛋白純化溶液 A1 mL1.5 mL 藍(lán)蓋管

GST 洗脫緩沖液成分一25 mL30 mL 本色瓶

GST 洗脫緩沖液成分二80 mg0.5 mL 棕色管

溶-菌酶，20 KU/mg30 mg0.5 mL 棕色管

Benzonase 溶液，1 U/?L100 ?L0.5 mL 紅蓋管

PMSF 溶液，10 mg/mL1 mL1.5 mL 白蓋管

6 mL 層析柱(帶篩板)1 套塑料袋

使用手冊1 份1 份

運輸及保存

GST 標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化試劑盒常溫運輸和保存，谷胱-甘肽-瓊脂糖溶液，GST 洗脫緩沖液成分二，溶菌-酶，20 KU/mg 需常溫運輸 4℃保存，Benzonase 溶液，1 U/?L 和 PMSF 溶液，10 mg/mL 需低溫運輸，-20℃保存。有效期一年

自備試劑

超純水

使用方法：

一：重組蛋白的表達(dá)和細(xì)菌收集

1.37℃振蕩培養(yǎng) 20 mL 含表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)菌到 OD600=0.6-0.8。

2.加 IPTG 到終濃度為 0.1 mM，30℃振蕩培養(yǎng) 3 小時或 22℃振蕩培養(yǎng) 8 小時（或過夜）。

3.4℃ 5000×g 離心 10 分鐘收集 20 mL 表達(dá)菌液，棄上清。

4.用 1×PBS 緩沖液重懸細(xì)菌沉淀，4℃ 5000 g 離心 10 分鐘，棄上清。沉淀可直接用于裂解或放-80℃保存。1×PBS 緩沖液可用自備的超純水稀釋本試劑盒提供的 10×

PBS 緩沖液而得。PBS 緩沖液極其容易長細(xì)菌，注意防止污染。

二：細(xì)胞裂解

5.如果用超聲波破碎細(xì)胞，先用 1 mL 冰浴的新鮮配制的細(xì)胞裂解液重懸細(xì)菌沉淀（細(xì)胞

裂解液的配制方法：在 1 mL 1×PBS 緩沖液中加入 50 ?L 溶液A 和 50 ?L 10 mg/mL 的 PMSF 溶液，混勻即可）。冰上超聲裂解重懸菌體直到在顯微鏡下看見絕大多數(shù)細(xì)胞破裂。超聲參數(shù)需根據(jù)儀器型號自行摸索，一般選 1K-10K 頻率處理 15 次，每次 20

秒，間隔 1 分鐘（必需放置在冰上）。裂解物不能粘稠，否則會堵塞層析柱。

6.如果用酶法破裂細(xì)胞，則在 1 mL 冰浴的、新鮮配制的細(xì)胞裂解液重懸細(xì)菌（細(xì)胞裂解液配制方法：在 1 mL 1×PBS 緩沖液中加入 1.5 mg 溶菌-酶干粉、50 ?L10 mg/mL 的 PMSF 溶液和 5 ?L Benzonase 溶液，混勻即可）。將重懸細(xì)菌冰上放置 30 分鐘， 得到細(xì)菌裂解物。

7.將超聲或酶法得到的細(xì)胞裂解物在 13000×g 4℃離心 10 分鐘去除未裂解細(xì)胞和裂解細(xì)胞碎片以防堵柱，所得上清即含可溶性 GST 標(biāo)記蛋白。預(yù)留少量（如 100 ?L）作為裂解液留樣，其余用于第 10 步的過柱。

三：層析柱的制備和 GST 蛋白純化

8.搖晃將 4 mL 谷胱-甘肽-瓊脂糖介質(zhì)充分混勻后，全部加入到預(yù)放了一片篩板的層析柱中

（介質(zhì)的最-低用量需要根據(jù) GST 蛋白產(chǎn)量決定，100 mL 菌液最少需要使用 200 ?L 介質(zhì)。此處加 2 mL 則綽綽有余）。下列步驟各溶液的用量均針對 4 mL 介質(zhì)而定，如果介質(zhì)用量不同，各溶液用量需相應(yīng)調(diào)整。

9.用 40 mL 預(yù)冷的 1×PBS 緩沖液洗柱。

10.將第 7 步得到的上清液（含可溶性 GST 標(biāo)記蛋白）上柱，讓重力使上柱液自然流出， 收集并保存穿透液用于 SDS-PAGE 電泳。GST 和谷胱-甘肽之間的結(jié)合很緩慢，所以流速一定不能快，否則結(jié)合不充分。流速一般在 0.2-1 mL/分鐘即可。如要提高 GST 標(biāo)記蛋白與介質(zhì)的結(jié)合效率，可用本試劑盒提供的紅蓋將層析柱下的漏液口堵上，讓細(xì)菌  裂解液和介質(zhì)在 4℃結(jié)合 30 分鐘或過夜。也可以將穿透液反復(fù)上柱。

11.用 10 mL 1×PBS 緩沖液洗柱，收集并保存穿透液（含雜蛋白）并預(yù)留100 ?L 作為穿透液留樣，其余在確認(rèn)實驗成功后再丟棄。

12.用 0.2-0.5 mL GST 洗脫液洗柱，收集并保存穿透液，此穿透液即純化的 GST 標(biāo)記蛋白樣品。GST 洗脫液的配制方法是將約 80 mg GST 洗脫液成分二干粉全部加入到GST 洗脫液成分一溶液中，搖晃直到干粉全部溶解即得 GST 洗脫液，分裝成小份放-20℃保存，每次用一管。由于它可能含蛋白酶污染，所以純化樣品不能在 4℃長期放置，需留100 ?L 左右用于后續(xù)濃度測定或/和 SDS-PAGE 電泳，其余放-80℃長期放置。

13. 用裂解液留樣（第 7 步）、穿透液留樣（第 11 步）和純化樣品留樣（第 12 步）進行蛋白定量或/和 SDS-PAGE 分析。注意：本操作沒有預(yù)先脫鹽，故只能用 Bradford 法或 OD 檢測法測定裂解液留樣、穿透液留樣和樣品留樣的蛋白濃度。按 OD 檢測法，1 OD280 約等于 0.5 mg/mL 蛋白。由于 GST 的分子量為 26 KD，所以在 SDS-PAGE 膠上，GST 標(biāo)記蛋白將比天然蛋白大 26 KD。

附：GST 柱的恢復(fù)（本試劑盒不含所需試劑）

1.用 3 倍介質(zhì)體積的 6 M 鹽酸胍處理柱子 10 分鐘。介質(zhì)為 2 mL 則用 6 mL，下同。

2.用 3 倍介質(zhì)體積的超純水處理柱子 10 分鐘。

3.用 3 倍介質(zhì)體積的緩沖液一（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 8.5）處理柱子 10分鐘；用 3 倍介質(zhì)體積的緩沖液二（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 4.5）處理柱子 10 分鐘。此步驟重復(fù)兩次。

4.用 3 倍介質(zhì)體積的超純水處理柱子 3 次。

5.若需要立即使用，則用 3 倍介質(zhì)體積的 1×PBS 緩沖液處理柱子 2 次。

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