目錄:上海烜雅生物科技有限公司>>分子生物學(xué)試劑>>試劑盒>> 通用免克隆質(zhì)粒DNA制備試劑盒
參考價(jià) | ¥ 2995 |
訂貨量 | ≥1盒 |
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更新時(shí)間:2025-05-20 09:04:01瀏覽次數(shù):72評(píng)價(jià)
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供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 50次 |
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貨號(hào) | XY-D-1850 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
主要用途 | 科研 | 英文名稱 | Universal Cloning-free Plasmid DNA Preparation Kit |
保存條件 | -20℃ | 有效期 | 1年 |
產(chǎn)品簡介:
分子克隆(Molecular Cloning)是分子生物學(xué)領(lǐng)域的奠基性技術(shù),它是利用質(zhì)粒作為載體來克隆所需的 DNA 片段,并利用大腸桿菌作為宿主進(jìn)行擴(kuò)增,使 DNA 片段取之不盡。分子克隆技術(shù)極大促進(jìn)了生物學(xué)的發(fā)展,但是,其缺點(diǎn)是耗時(shí)并且步驟繁多,從連接到重組子鑒定一般需要 3-7 天(取決于宿主細(xì)胞)。為克服此缺點(diǎn),本公司根據(jù)滾環(huán)擴(kuò)增原理開發(fā)了本產(chǎn)品。
產(chǎn)品特點(diǎn):
1.即開即用,十分方便,用戶不需要辛苦摸索條件。
2.起始材料為 DNA 片段-載體連接產(chǎn)物或 DNA 片段自身環(huán)化產(chǎn)物,到擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定最快只需要 6 小時(shí)完成(擴(kuò)增 4 小時(shí)+酶切鑒定 2 小時(shí))。如果起始 DNA 少, 則需要更長的時(shí)間。
3.使用自備的 DNA 插入片段專一的引物,只擴(kuò)增帶有 DNA 插入片段的重組質(zhì)粒, 不擴(kuò)增自連載體。如果連接反應(yīng)時(shí)已經(jīng)排除了載體自身環(huán)化,則可以使用本試劑盒提供的 RCA 引物。
4.適用于任何長度的 DNA,也適用于對(duì)宿主有毒的 DNA 和在宿主細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定的重復(fù) DNA。
5.不需要感受態(tài)細(xì)胞。
6.所得質(zhì)粒 DNA 沒有任何 RNA、宿主 DNA 或內(nèi)毒素的污染。
7.高保真,所得 DNA 跟分子克隆制備的 DNA 一樣的保真率。
8.所得 DNA 可以直接用于酶切、一代和二代測(cè)序、轉(zhuǎn)染和酵母轉(zhuǎn)化。酶切和自身環(huán)化后還可以轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
9.含熒光染料,可以實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增的進(jìn)行。
10.本產(chǎn)品足夠 50 次 10uL 體系的免克隆質(zhì)粒制備反應(yīng)。
11.通用免克隆質(zhì)粒DNA制備試劑盒只能用于科研。
產(chǎn)品參數(shù):
成份規(guī)格包裝
dNTP-染料混合液75 uL0.5mL 藍(lán)蓋管
RCA 專用隨機(jī)引物溶液100 uL0.5mL 白蓋管
phi29 DNA 聚合酶,10U/uL25 uL0.5mL 紅色管
10×Phi29 DNA 聚合酶緩沖液50 uL0.5mL 綠色管
使用手冊(cè)1 份無
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸,-20℃保存,有效期為一年。
自備試劑
插入片段專一性引物、超純水。
使用方法:
1.用常規(guī)方法進(jìn)行插入片段和克隆載體的連接。由于本產(chǎn)品基于滾環(huán)擴(kuò)增,故只能 擴(kuò)增沒有切口的環(huán)狀的 DNA。因此在連接時(shí),需要注意兩點(diǎn):一是最好通過粘性末端不同或堿性磷酸酶處理載體,防止載體自連,這樣就可以使用本試劑盒提供 的 RCA 專用隨機(jī)引物,不必再合成插入片段專一的引物。二是樣本中必須有一條沒有任何切口,變性后還是環(huán)狀單鏈的 DNA。常規(guī)的 AT 克隆,由于 PCR 片段的兩個(gè) 5’端沒有磷酸化,所以連接后重組質(zhì)粒的四個(gè)切口其實(shí)只連接上了兩個(gè),另外兩個(gè)并沒有連接上。這種帶切口的重組質(zhì)粒并不影響轉(zhuǎn)化,但不能進(jìn)行RCA 擴(kuò)增,因?yàn)?DNA 變性后兩條 DNA 鏈其實(shí)還是線狀 DNA。所以這種 PCR 片段需要先磷酸化,或者 PCR 的時(shí)候就用 5 端磷酸化的引物,這樣連接后才能用于 RCA 擴(kuò)增。
2.按下表設(shè)置 10uL 的環(huán)狀 DNA RCA 反應(yīng):
成分管 1
(樣本)管 2
(無模板對(duì)照)
連接產(chǎn)物,100pg1 uL-
RCA 專用隨機(jī)引物溶液2 uL2 uL
自備 DNA 插入片段專一性引物(注)40pmol40pmol
dNTP-染料混合液1.5 uL1.5 uL
10×Phi29 DNA 聚合酶緩沖液1 uL1 uL
加超純水到到水到 9.5 uL加水到 9.5 uL
在 PCR 儀器上 95℃ 3 分鐘,放室溫待溫度下降到常溫后加入
phi29 DNA 聚合酶,10U/uL0.5 uL0.5 uL
合計(jì)10 uL10 uL
注:自備引物的方向跟常規(guī) PCR 的方向相反,長度只要 6-10 個(gè)堿基即可。使用時(shí)必須跟本試劑盒提供的 RCA 專用隨機(jī)引物共同使用。
3.放熒光定量 PCR 儀器上,設(shè)置 30℃保溫 16 小時(shí),每 10 分鐘設(shè)置成一個(gè)循環(huán), 采集一次 SYBR 通道的熒光信號(hào)。由于是實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng),所以反應(yīng)不一定要 16 小時(shí)后終止,可以在擴(kuò)增曲線進(jìn)入平臺(tái)期后(已經(jīng)沒有新的 DNA 合成)提前結(jié)束。如果沒有熒光定量 PCR 儀器,則只能電泳檢測(cè)或 PCR 檢測(cè)是否有擴(kuò)增。
4.典型實(shí)驗(yàn)結(jié)果。有擴(kuò)增的樣本將有平緩的 S 熒光曲線,無模板對(duì)照將沒有此標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線(見下圖)或擴(kuò)增曲線:
5.65℃保溫 10 分鐘滅活 phi29 DNA 聚合酶。由于 phi29 DNA 聚合酶有很強(qiáng)的 3-5 外切酶活性,因此必須滅活,否則它將逐漸降解已經(jīng)合成的 DNA。
6.擴(kuò)增所得質(zhì)粒 DNA 為超分支結(jié)構(gòu),直接電泳就是模糊一片,并不能進(jìn)行分析鑒定。因此必須先酶切再電泳。可以選擇跟常規(guī)重組子鑒定一樣的酶進(jìn)行酶切電泳, 也可以用菌落 PCR 一樣的方法進(jìn)行菌落 PCR 來判斷是否克隆成功。擴(kuò)增產(chǎn)物也可以直接用于轉(zhuǎn)染、酵母轉(zhuǎn)化、一代或二代測(cè)序。如果轉(zhuǎn)化大腸桿菌,則需要先用只酶切重組質(zhì)粒一次的限制性內(nèi)切酶酶切,再自連,再轉(zhuǎn)化。也可以用超純水將 1uL 擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋 100 倍后再用 1uL 稀釋液作為模板,再進(jìn)行 RCA 擴(kuò)增,得到更多的 DNA。
選擇我們的通用免克隆質(zhì)粒DNA制備試劑盒,就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測(cè)方案,為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航!
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