高效薄層層析是把支持物均勻涂布于支持板上形成薄層，然后用相應(yīng)的溶劑進(jìn)行展開。薄層層析可根據(jù)作為固定相的支持物不同，分為薄層吸附層析、薄層分配層析、薄層離子交換層析、薄層凝膠層析等。一般實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較多的是以吸附劑為固定相的薄層吸附層析。高效薄層層析的操作過程包括制板、點(diǎn)樣、展層、顯色、定位檢測(cè)、洗脫和進(jìn)一步的定量分析等步驟。
1.制板:稱取硅膠GF5g,加入0.4%聚乙烯醇2mL,在小燒杯中攪拌至變成黏稠狀時(shí),開始鋪板,一般可制20cmX8cm的玻璃4~5塊。制好的薄層板在室溫下晾干,用前在110C烘箱中活化30min。
2.點(diǎn)樣:取兩塊薄層板,在第一塊板上準(zhǔn)備點(diǎn)含有IAA、ABA和GA的甲醇溶解液,第二塊板點(diǎn)含有CTK的乙醇溶解液。其操作方法:用微量注射器吸取100μL樣液,分3-4次點(diǎn)在距薄板邊緣1cm的位置上,樣點(diǎn)直徑要求不超過3mm,各點(diǎn)之間的距離1-1.5cm。點(diǎn)完待測(cè)樣后，再分別點(diǎn)上IAA、GA3和ABA三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣。第二塊板的操作相同,只是標(biāo)準(zhǔn)樣用CTK。
3.展層:將點(diǎn)樣后的薄層板架放在盛有展開劑的層析缸中,先不與展開劑接觸,加蓋后飽和1h,再將薄層板的點(diǎn)樣端浸人展開劑中3~4mm,當(dāng)展開劑前沿距頂端1cm左右時(shí),停止展層。
4.定位檢測(cè):展層完畢后,微風(fēng)吹干,并在紫外燈下觀察色斑，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣點(diǎn)的位置來確定未知樣點(diǎn)中各內(nèi)源激素的位置,并用鉛筆圈出范圍進(jìn)行定位。注意應(yīng)盡量縮短在紫外燈下觀察的時(shí)間,避免樣品分解。
5.洗脫:將含有激素色斑的硅膠分別刮下,用95%乙醇浸提(洗脫)3次,每次1h,合并浸提液,N2吹干或減壓蒸干后,用pH5.4的檸檬酸-磷酸緩沖液溶解、定容,供進(jìn)一步定量檢測(cè)之用。
6.定量:用pH5.4的檸檬酸-磷酸緩沖液溶解、定容后可采用氣相色譜、酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)或其他方法進(jìn)行定量分析。
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