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ELISA試劑盒的典型組成：

一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的ELISA試劑盒通常包含以下組件：

1、預(yù)包被微孔板： 96孔或48孔塑料板，孔內(nèi)已預(yù)先包被好捕獲抗體或抗原（根據(jù)類(lèi)型而定）。這是反應(yīng)發(fā)生的場(chǎng)所。

2、酶標(biāo)二抗（或酶標(biāo)檢測(cè)抗體/抗原）： 根據(jù)ELISA類(lèi)型，提供辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗（用于間接法或夾心法），或酶標(biāo)抗原（用于競(jìng)爭(zhēng)法）。

3、標(biāo)準(zhǔn)品： 已知精確濃度的抗原（或抗體）系列梯度溶液。用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本中待測(cè)物的濃度。

4、檢測(cè)抗體（僅夾心法）： 未標(biāo)記的、針對(duì)抗原另一表位的抗體。

5、樣品稀釋液： 用于稀釋樣本，使其基質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)品和緩沖體系匹配，減少非特異性干擾。

6、洗滌緩沖液： 通常為含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。用于在各步驟之間洗去未結(jié)合的物質(zhì)，減少背景干擾。洗滌是否是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵！

7、封閉液： 常用牛血清白蛋白或脫脂奶粉溶液。用于在包被后封閉微孔板上未結(jié)合的位點(diǎn)，防止后續(xù)步驟中的非特異性吸附，降低背景。

8、底物溶液：

對(duì)于HRP：常用四甲基聯(lián)苯胺或3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺。

對(duì)于AP：常用對(duì)硝基苯磷酸酯。

9、終止液：

對(duì)于HRP-TMB：常用稀硫酸溶液。

對(duì)于AP-pNPP：常用氫氧化鈉溶液。用于終止酶促反應(yīng)，穩(wěn)定最終顏色。

10、板封膜： 在孵育步驟中覆蓋微孔板，防止蒸發(fā)和污染。

11、說(shuō)明書(shū)： 詳細(xì)的操作步驟、試劑保存條件、注意事項(xiàng)、預(yù)期結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法等。

樣本處理及要求：

1. 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱(chēng)重后將剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè)。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

5. 其它生物標(biāo)本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)。

6. 樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

7. 樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

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