干貨分享 ｜ 基因沉默怎么做 RNA干擾技術(shù)來助你!

RNA 干擾是一種通過 RNA 分子介導(dǎo)的基因沉默機制，相較于常規(guī)的抑制劑，RNA 干擾技術(shù)具有無靶點限制、特異性強、生物毒性低等優(yōu)點。常見的應(yīng)用于 RNA 干擾的寡核苷酸有小干擾 RNA (siRNA)、微小 RNA (miRNA) 和反義寡核苷酸 (ASO) 等 (圖 1) ，其基本原理是利用 siRNA、miRNA 或 ASO 與特定的目標基因 mRNA 序列相互作用，從而誘導(dǎo)靶基因的降解或抑制其翻譯，進而實現(xiàn)對特定基因的沉默或抑制。

圖 1. 常見的 RNA 干擾寡核苷酸。

miRNA、siRNA 屬于雙鏈 RNA，一般包含 20 個左右的核苷酸。短發(fā)夾 RNA (shRNA) 是單鏈 RNA。shRNA 被設(shè)計成能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，當(dāng)進入細胞后，shRNA 被 Dicer 酶切割成 siRNA。

原理：miRNA、siRN 或 shRNA 進入細胞質(zhì)中，短雙鏈 RNA 解旋后正義鏈被降解。反義鏈與多種蛋白組分形成 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體 (RNA Induced Silencing Complex, RISC) 。RISC 中保留的反義鏈與靶基因的 mRNA 特異地互補，同時 RISC 具有核酸酶活性，能將靶基因的 mRNA 切割降解，抑制靶基因的表達 (圖 2) 。

值得注意的一點是，如果 siRNA 或者 miRNA 和 mRNA 不完-全互補，則 siRNA 或者 miRNA 與靶基因的 3’ 端-非翻譯區(qū)的序列形成非完-全互補的雜交雙鏈，miRISC 結(jié)合在雜交雙鏈上，特異性的抑制基因表達。

圖 2. siRNA、miRNA、shRNA、ASO 的作用機制^[1]。

反義寡核苷酸 (ASOs) 通常指的是短小的、人工合成的單鏈 DNA 或 RNA (13 至 30 個核苷酸)。反義寡核苷酸的作用機制主要包括兩種方式：一是通過空間阻擋，干擾其他分子與靶 RNA 的結(jié)合；二是誘導(dǎo)靶 mRNA 降解。反義寡核苷酸能夠與成熟 mRNA 結(jié)合阻止其附著在核糖體上，阻斷蛋白質(zhì)翻譯或招募 RNase H 引起 mRNA 的降解 (圖 2)。

除了上述這些 RNA 干擾技術(shù)之外，小激活 RNA (saRNA) 作為一種能夠特異性的上調(diào)基因表達的寡核苷酸，也已經(jīng)應(yīng)用于基因功能的研究中。

saRNA 的作用機制如下：

1）外源性 saRNA 被加載到細胞質(zhì)中的 AGO2 蛋白上；

2）AGO2 蛋白通過切割和丟棄其中一條 RNA 鏈，形成一個活性的 AGO2-RNA 復(fù)合物，并進入細胞核；

3）AGO2-RNA 復(fù)合物將結(jié)合到基因組 DNA 序列或 DNA 相連的反義轉(zhuǎn)錄本序列，進一步形成 RNA 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物；

4）該復(fù)合物與 hnRNPs、RNAPⅡ 和各種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因表達。

SaRNA 作為一種新興的基因調(diào)控技術(shù)，其具有的小分子量、基因特異性，以及激活基因表達的作用特點使其成為正向調(diào)節(jié)基因表達的藥物熱門候選。

應(yīng)用一：實現(xiàn) mRNA 敲減 

ASO 與靶標 mRNA 雜交后可以引發(fā) RNA 酶 H 的作用，并且導(dǎo)致靶標 RNA 的水解，ASO 與靶標 RNA 結(jié)合后也可以通過空間阻礙的方式抑制 mRNA 的翻譯過程。

應(yīng)用二：調(diào)節(jié)前體 mRNA 的剪接

根據(jù) pre-mRNA 序列設(shè)計的 ASO 能夠與目標 pre-mRNA 的外顯子及內(nèi)含子的交界處互補。ASO 與 pre-mRNA 配對形成的雙鏈區(qū)域能夠遏制該位置被識別，引起與 ASO 互補的外顯子在 pre-mRNA 成熟過程中被整段剪切掉。通過這種方式，可以實現(xiàn)對 mRNA 可變剪接功能的研究。

應(yīng)用三：切除 mRNA5' 端帽子結(jié)構(gòu)

如鑭系元素大環(huán)復(fù)合物已被證明可通過親核攻擊三磷酸鍵，特異性地化學(xué)切除 5' 端 7'-甲基鳥苷殘基。利用結(jié)合了鑭系元素大環(huán)復(fù)合物的 ASO 可以有效的去除 mRNA5' 端帽子結(jié)構(gòu)。

應(yīng)用四：調(diào)節(jié) mRNA 多聚腺苷酸化位點

真核細胞基因通常被發(fā)現(xiàn)有不止一個多聚腺苷酸化位點。采用 ASO 對前體 mRNA 中的一個多聚腺苷酸化位點進行特異性結(jié)合，使 E 選擇蛋白 (E-selectin) 在加尾時不得不使用上游的多聚腺苷酸化位點，進而達到調(diào)節(jié) mRNA 多聚腺苷酸化位點的目的。

寡核苷酸藥物具有研發(fā)周期短、特異性強、高效性和長效性等明顯性優(yōu)勢，成為近年來全球資本和藥企爭相布局的新賽道。國內(nèi)研究最多的寡核苷酸藥物類型是 siRNA，大部分處于臨床前階段，部分臨床藥物見下表。

表 1. 部分 RNA 臨床在研藥物。

 

產(chǎn)品推薦

Patisiran sodium (HY-132609) Patisiran sodium 是一種雙鏈小干擾 RNA，靶向 Transthyretin (TTR) 信使 RNA 內(nèi)的序列。

Inclisiran sodium (HY-132591A) Inclisiran sodium 是一種雙鏈小干擾 RNA (siRNA) 分子，可抑制 PCSK9 的轉(zhuǎn)錄。

MicroRNA Mimic Negative Control (HY-R04602) MicroRNA Mimic Negative Control 是 21 個核苷酸的 miRNA 模擬物，可作為陰性對照使用。

Fomivirsen sodium (HY-109528) Fomivirsen (ISIS-2922) 是一種反義 21 mer 磷酸硫寡核苷酸。

Nusinersen sodium (HY-112980A) Nusinersen sodium 是一種反義寡核苷酸活性分子，修飾 SMN2 基因的前信使 RNA 剪接。

Mipomersen sodium (HY-108764) Mipomersen sodium (ISIS 301012) 是載脂蛋白 B (apoB) 的反義寡核苷酸抑制劑。

Inotersen sodium (HY-132608) Inotersen (ISIS-420915) sodium 是一種 2'-O-甲氧基乙基修飾的反義寡核苷酸。

Givosiran (HY-132610) Givosiran (ALN-AS1) 是一種小干擾 RNA，靶向肝臟氨基纖維素合酶 1 (ALAS1) 信使 RNA。

Bepirovirsen sodium (HY-147217A) Bepirovirsen sodium 是一種反義寡核苷酸，靶向所有 HBV 信使 RNAs。

Nusinersen (HY-112980) Nusinersen是一種反義寡核苷酸活性分子，修飾 SMN2 基因的前信使 RNA 剪接。

 

[1] Weng Y, et al. RNAi therapeutic and its innovative biotechnological evolution. Biotechnol Adv. 2019 Sep-Oct;37(5):801-825. 

[2] Ebenezer O, et al. Development of Novel siRNA Therapeutics: A Review with a Focus on Inclisiran for the Treatment of Hypercholesterolemia. Int J Mol Sci. 2023 Feb 16;24(4):4019.