請(qǐng)問(wèn) ICC 和 IF 有何區(qū)別？是同一個(gè)實(shí)驗(yàn)嗎？
哎嘿，這題我會(huì)!
免疫細(xì)胞化學(xué) (Immunocytochemistry, ICC) 在細(xì)胞樣本上對(duì)靶抗原進(jìn)行檢測(cè)和定位。免疫熒光 (Immunofluorescence, IF) 則是主要使用熒光標(biāo)記物對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原的可視化檢測(cè)。熒光標(biāo)記既可以用于免疫細(xì)胞化學(xué)法 (細(xì)胞) 也可以用于免疫組織化學(xué)法 (組織)。
哇哦~曉得了，有沒(méi)有操作流程嘞?
流程？在下面嘍~
Section.01
第一步: 樣品準(zhǔn)備
細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是一種基于抗體與標(biāo)記物相互作用的技術(shù)。它通過(guò)特異性的抗體與細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)分子結(jié)合，再通過(guò)標(biāo)記物在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)流程通常包括樣品制備、固定、通透、封閉、抗體孵育、復(fù)染、封片和觀察 8 個(gè)部分。
圖 1. ICC/IF 實(shí)驗(yàn)流程圖。
目的
根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，準(zhǔn)備狀態(tài)良好的細(xì)胞樣品。細(xì)胞培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，細(xì)胞狀態(tài)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
步驟
1. 準(zhǔn)備蓋玻片或共聚焦小皿。蓋玻片需提前浸泡在 70% 乙醇中，蓋玻片完-全干燥后移至細(xì)胞培養(yǎng)板中，整個(gè)過(guò)程注意無(wú)菌操作。
2. 鋪細(xì)胞。在包被的蓋玻片或板上鋪適當(dāng)?shù)募?xì)胞，使后續(xù)固定細(xì)胞時(shí)，融匯度達(dá)到 50-60%。如果細(xì)胞過(guò)密或過(guò)稀，正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)可能會(huì)受到影響。
3. 收集樣品。針對(duì)貼壁細(xì)胞，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 12 h，細(xì)胞牢牢貼壁后，收集樣品進(jìn)行后續(xù)操作。而對(duì)于懸浮細(xì)胞，可以通過(guò)甩片進(jìn)行。
Tips:
1. 盡量選用新鮮制備的樣本，并確定樣品中抗原分子的表達(dá)豐度；
2. 后續(xù)所有操作，動(dòng)作要輕柔，避免細(xì)胞脫落；
3. 后續(xù)所有操作都需避免干片。
Section.02
第二步: 固定
目的
使用固定劑 (如甲醇、丙酮、多聚甲醛等) 處理細(xì)胞，使蛋白質(zhì)變性凝固，從而固定細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)。同時(shí)，固定劑還能減少或終止內(nèi)源性或外源性細(xì)胞內(nèi)分解酶的反應(yīng)，防止組織細(xì)胞自溶，保護(hù)抗原性。
固定劑的選擇
步驟
1. 固定：使用 4% 的多聚甲醛固定細(xì)胞 10 ~ 15 min；
2. 洗滌：使用 PBS 緩沖液清洗 3 次，以去除殘留的固定液。
Tips:
1. 初次實(shí)驗(yàn)，建議從 4% 的多聚甲醛,固定 15 min 開(kāi)始嘗試，倘若沒(méi)有達(dá)到預(yù)期效果，再調(diào)整固定時(shí)間或更換另一種固定劑。
2. 較長(zhǎng)的孵育時(shí)間通常會(huì)導(dǎo)致更高的固定程度，直至表位可能過(guò)度固定。孵育時(shí)間短可能導(dǎo)致表位保存不良和樣品固定不足。最佳固定時(shí)間需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。
Section.03
第三步: 通透
目的
通過(guò)去污劑部分溶解細(xì)胞膜，形成孔洞，從而使抗體能夠到達(dá)細(xì)胞內(nèi)表位，與細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合。(該步驟可選做；通透步驟會(huì)破壞細(xì)胞膜，細(xì)胞膜表面抗原不適合選擇通透實(shí)驗(yàn))
圖 2. 細(xì)胞膜打孔處理示意圖。
通透劑的選擇
步驟
1. 通透：加入 0.1–0.25 % Triton X-100 (PBS 配制)，覆蓋細(xì)胞，室溫下通透 5-10 min ；
2. 洗滌：使用 PBS 緩沖液清洗 3 次，以去除殘留通透液。
Tips:
通透劑的濃度和孵育時(shí)間應(yīng)針對(duì)所用樣品進(jìn)行優(yōu)化。
Section.04
第四步: 封閉
目的
封閉液中的成分能夠與細(xì)胞表面的非特異性位點(diǎn)結(jié)合，從而阻止抗體與這些位點(diǎn)的非特異性結(jié)合。
封閉液的選擇
可以選擇與二抗相同來(lái)源的血清或者 BSA 等，例如，若二抗為山羊抗小鼠，應(yīng)選擇山羊血清作為封閉劑。
步驟
使用 2-10% 的 BSA/山羊血清，室溫或 37 ℃ 封閉 1 h。
Tips:
1. 封閉溶液不應(yīng)含有一抗的宿主動(dòng)物血清，因?yàn)檫@可能會(huì)導(dǎo)致高背景。
2. 注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。
Section.05
第五步: 抗體孵育
目的
使抗體充分與目的蛋白抗原結(jié)合，決定了熒光信號(hào)的位置和特異性，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
注意：該步驟可選擇 (i) 直接檢測(cè)，一抗直接與熒光基團(tuán)偶聯(lián)。(ii) 間接檢測(cè)，使用合適的熒光標(biāo)記二抗檢測(cè)一抗。這兩種方法各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，其中，間接檢測(cè)是最常-用的檢測(cè)方法。
圖 3. 直接法和間接法示意圖。
抗體的選擇
1. 單染：一抗要選擇任一宿主來(lái)源的抗體，二抗選擇對(duì)應(yīng)的抗一抗宿主的抗體。例如，一抗是小鼠來(lái)源，二抗要選擇抗小鼠的抗體 (如山羊抗小鼠，驢抗小鼠等)。
2. 雙染/多染：在進(jìn)行多個(gè)熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)時(shí)，一抗要選擇不同宿主來(lái)源的抗體，二抗選擇對(duì)應(yīng)的抗一抗宿主的抗體。同時(shí)要注意選擇具有高區(qū)分度的熒光二抗，避免熒光重疊。例如，在進(jìn)行三色熒光標(biāo)記時(shí)，一般選用綠色、藍(lán)色和紅色這三種熒光基團(tuán)，以確保每個(gè)信號(hào)都能被清晰地區(qū)分出來(lái)。
步驟
(以間接檢測(cè)為例)：
1. 一抗孵育：根據(jù)研目標(biāo)抗原和樣品特性選擇符合要求的一抗，并按照說(shuō)明書(shū)要求稀釋一抗，加入到樣品中并在 4 ℃ 條件下孵育過(guò)夜 (12~16 h)。
2. 洗滌：回收一抗工作液，用 TBST/PBST 搖床緩慢清洗 3 次，每次 5~10 min，以去除未結(jié)合的抗體。洗滌次數(shù)和時(shí)間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整。
3. 二抗孵育：根據(jù)一抗的種類(lèi)及樣品特性 (二抗攜帶的熒光需要與樣品自帶熒光不沖突) 選擇合適的熒光標(biāo)記的二抗，在室溫下避光孵育 1 h。稀釋和使用方法應(yīng)遵循說(shuō)明書(shū)。
4. 洗滌：去除/回收二抗工作液，用 TBST/PBST 搖床緩慢清洗 3 次，每次 5 ~ 10 min，以去除未結(jié)合的抗體。洗滌次數(shù)和時(shí)間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整。
Tips:
1. 孵育熒光二抗之后，一定要注意避光保存！
2. 確定合適的二抗工作濃度濃度，避免無(wú)信號(hào)或背景過(guò)高現(xiàn)象的發(fā)生；
3. 注意濕盒的保濕效果，避免樣品的干燥；
4. 洗滌時(shí)轉(zhuǎn)速要溫和，防止細(xì)胞脫片。
Section.06
第六步: 復(fù)染
目的
使用染色劑對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，直觀地區(qū)分細(xì)胞核和其他細(xì)胞及抗原結(jié)構(gòu)的位置，便于觀察和解讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
步驟
在清洗完畢的細(xì)胞中滴加 DAPI，室溫避光靜置約 30 s。
Section.07
第七步：封片
目的
保護(hù)已經(jīng)染色的樣本，防止其受到外界環(huán)境的損害。同時(shí)，封片還有助于保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果，便于后續(xù)的分析和比較。
步驟
1. 封片：向載玻片上加入一滴封片劑，將蓋玻片緩慢扣在載玻片上，細(xì)胞所在面靠近載玻片，用吸水紙吸除多余封片劑。
2. 觀察：輕輕用指甲油密封蓋玻片四周，避免樣品在顯微鏡下移動(dòng)。指甲油干透后，直接觀察或 4 ℃ 下避光保存。
Tips:
1. 避免氣泡：在封片過(guò)程中，需要避免產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)干擾顯微鏡下的觀察，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，在滴加封片液時(shí)，需要緩慢而均勻地滴加，并用鑷子輕輕調(diào)整蓋玻片的位置，以確保沒(méi)有氣泡產(chǎn)生。
2. 選擇合適的封片劑：封片劑的選擇也很重要。常用的封片劑包括緩沖甘油、抗熒光淬滅封片液等。在選擇封片劑時(shí)，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體需求和標(biāo)本的特性進(jìn)行選擇。
3. 保持避光和濕度：封片后，需要將標(biāo)本放置在避光和濕度適宜的環(huán)境中保存。這可以有效地防止熒光信號(hào)的淬滅和標(biāo)本的干燥，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。
4. 細(xì)胞樣品在封片劑處理后，理論上可以在 -20℃/4℃ 冰箱保存 1 周。然而，為了成像清晰和高熒光強(qiáng)度，建議盡快進(jìn)行成像分析。
Section.08
第八步: 觀察
成像及分析：在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像，并對(duì)熒光定位及結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。
怎么樣？有沒(méi)有躍躍欲試的小念頭？讓我們?cè)賮?lái)看看科研人的期刊文獻(xiàn)中的免疫熒光 (IF) 成果圖吧！
圖 4. 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)免疫熒光圖[1]。
好啦，朋友們，到這里細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)就結(jié)束啦！你學(xué)會(huì)了嗎？從準(zhǔn)備樣本開(kāi)始，一步步進(jìn)行固定和抗體孵育，再到最后在顯微鏡下看到那些閃閃發(fā)光的細(xì)胞，真的超有成就感！
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[1] Thul PJ, et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 2017 May 26;356(6340):eaal3321.
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