液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱（固定相） 內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過程，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。

 

　　液相色譜儀按其分離機(jī)理，可分為四種類型。

 

　　吸附色譜法的固定相為吸附劑，色譜的分離過程是在吸附劑表面進(jìn)行的，不進(jìn)入固定相的內(nèi)部。與氣相色譜不同，流動(dòng)相（即溶劑）分子也與吸附劑表面發(fā)生吸附作用。在吸附劑表面，樣品分子與流動(dòng)相分子進(jìn)行吸附競爭，因此流動(dòng)相的選擇對分離效果有很大的影響，進(jìn)口液相色譜儀一般可采用梯度淋洗法來提高色譜分離效率。

 

　　在聚合物的分析中，吸附色譜一般用來分離添加劑，如偶氮染料、抗氧化劑、表面活性劑等，也可用于石油烴類的組成分析。

 

　　分配色譜法

 

　　這種色譜的流動(dòng)相和固定相都是液體，樣品分子在兩個(gè)液相之間很快達(dá)到平衡分配，利用各組分在兩相中分配系數(shù)的差異進(jìn)行分離，類似于萃取過程。

 

　　一般常用的固定液有（ODPN）、聚乙二醇（PEG400～4000）、*撐乙二醇（TMG）和角鯊?fù)椋⊿Q）。采用與氣相色譜（GC）同樣的方法，將固定液涂漬在多孔的載體表面，但在使用中固定液易流失。目前，應(yīng)用較多的是鍵合固定相。在這種固體相中，固定液不是涂在載體表面，而是通過化學(xué)反應(yīng)在純硅膠顆粒表面鍵合上某種有機(jī)基團(tuán)。

 

　　例如，利用氯代十八烷基硅烷與硅膠表面的羥基（-OH）之間的反應(yīng)就可以形成一烷基化表面。這種固定液的優(yōu)點(diǎn)是不易被流動(dòng)相剝蝕。在分配色譜法中，流動(dòng)相可為純?nèi)軇?，也可以采用混合溶劑進(jìn)行梯度淋洗，其極性應(yīng)與固定液差別大一些，以避免兩者之間相溶。

 

　　與試樣預(yù)處理技術(shù)相配合，液相色譜儀所達(dá)到的高分辨率和高靈敏度，使分離和同時(shí)測定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能，能夠分離復(fù)雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)展，有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離。

 

　　液相色譜儀有“四高一廣”的特點(diǎn)：

 

　　①高壓：流動(dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。

 

　　②高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)。

 

　　③：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。

 

　?、芨哽`敏度：紫外檢測器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在μL數(shù)量級。

 

　?、輵?yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢。

 

　　⑥柱子可反復(fù)使用：用一根柱子可分離不同化合物

 

　?、邩悠妨可?、容易回收：樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

 

　　此外液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)，與氣相色譜相比各有所長，相互補(bǔ)充。液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”。在從進(jìn)樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動(dòng)相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。

 

　　液相色譜儀成為解決生化分析問題zui有前途的方法。由于液相色譜儀具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復(fù)利用，流出組分易收集等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無機(jī)分析等各種領(lǐng)域。液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個(gè)重要的發(fā)展方向。

 

　　液相色譜儀質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)受到普遍重視，如分析氨基甲酸酯農(nóng)藥和多核芳烴等； 液相色譜- 紅外光譜聯(lián)用也發(fā)展很快，如在環(huán)境污染分析測定水中的烴類，海水中的不揮發(fā)烴類，使環(huán)境污染分析得到新的發(fā)展。

 

　　造成這種情況的原因一般是色譜柱被污染，或柱頭填料塌陷導(dǎo)致的。

 

　　進(jìn)口液相色譜儀對于*種情況，先用純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇（4+6）沖洗柱子（沖洗時(shí)間的長短由樣品污染的情況而定），再換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，zui后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳，則考慮第二種情況。

 

　　對于第二種情況，擰開柱頭，檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷。去除硬結(jié)部分（污染的填料），裝入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊，再填平，滴甲醇，再壓緊反復(fù)幾次，直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈，擦凈柱外壁的填料，擰緊柱頭，用純甲醇沖洗30分鐘以上。

 

　　對液相色譜儀的要求

 

　　1.流動(dòng)相必須用HPLC級的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)（使用0.45μm或更細(xì)的膜過濾）。

 

　　2.流動(dòng)相過濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。

 

　　3.不能用純乙腈作為流動(dòng)相，這樣會使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進(jìn)液。

 

　　4.使用緩沖溶液時(shí)，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，然后用甲醇（或甲醇水溶液）沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20mL以上。

 

　　5.長時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相（如，甲醇等），因?yàn)?，純水易長霉。

 

　　6.每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑清洗進(jìn)樣器。

 

　　7.C18柱不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。

 

　　8.堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱→混合器中的過濾器→管路過濾器→單向閥檢查并清洗，清洗方法：

 

　?、僖援惐甲魅軇_洗；

 

　　②放在異丙醇中間用超聲波清洗；

 

　?、塾?0％稀硝酸清洗；

 

　　9.氣泡會致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。

 

　　10.如果進(jìn)液管內(nèi)不進(jìn)液體時(shí)，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相的清洗。

 

　　11.進(jìn)口液相色譜儀要注意柱子的pH值范圍，不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品。

 

　　12.更換流動(dòng)相時(shí)應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動(dòng)邊靖洗，然后插入新的流動(dòng)相中。更換無互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過渡一下。