血液中血清蛋白及其他球蛋白的分離方法

一、實(shí)驗(yàn)原理

帶電質(zhì)點(diǎn)在電場作用下，帶正電荷的移向負(fù)極，帶負(fù)電荷的移向正極，這種現(xiàn)象稱為電泳。蛋白質(zhì)分子具有許多可解離的酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)，在一定的pH條件下，它會(huì)解離而帶電，在某一pH下，蛋白質(zhì)分子中所帶的正電荷數(shù)恰好等于負(fù)電荷數(shù)，即分子靜電荷等于零。此時(shí)蛋白質(zhì)分子在電場中不移動(dòng)，溶液的這一PH值稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

當(dāng)溶液的pH小于該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，則蛋白質(zhì)分子會(huì)結(jié)合一部分H離子而帶正電荷，在電場中就會(huì)向負(fù)極移，反之，如果溶液的pH大于該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，則蛋白質(zhì)分子會(huì)解離出一部分H離子而帶負(fù)電荷，在電場中就會(huì)向正極移動(dòng)。

由于各蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，在相同的pH溶液中所帶的電荷性質(zhì)不同，電荷的數(shù)目不同，因而在電場中泳動(dòng)的方向和速度也不相同，從而使混合樣品中的蛋白質(zhì)各組分得到分離。

本實(shí)驗(yàn)采用的醋酸纖維薄膜電泳是以醋酸纖維薄膜為支持物。醋酸纖維薄膜對蛋白質(zhì)樣品吸附極少而無“拖尾”現(xiàn)象。

本方法快速省時(shí)、靈敏度高、樣品用量少、操作簡單，目前已廣泛用于分析檢測血漿蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎兒甲種球蛋白、體液、脊髓液、脫氫酶、多肽、核酸及其他生物大分子，為心血管病，肝硬化及某些癌癥鑒別診斷提供了可靠的依據(jù)，因而已成為醫(yī)學(xué)和臨床檢驗(yàn)的常規(guī)技術(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)用品

  （一）器材

（1）電泳儀和臥式電泳槽。

（2）分光光度計(jì)。

（3）醋酸纖維薄膜。

（4）培養(yǎng)皿和點(diǎn)樣玻璃片。

（二）試劑  

（1）Barbitalum：Barbiturate sodium緩沖液

（2）染色液：稱取0.5g氯基黑10B，加入蒸餾水40ml,甲醇50ml和冰醋酸10ml混勻，在具塞試劑瓶內(nèi)貯存。

（3）透明液：冰醋酸25ml,加 95%乙醇75ml。

（4）漂洗液：乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸餾水50ml。

（6）定量洗脫液：0.4mol/L NaOH溶液。

（三）材料

      新鮮血清（無溶血現(xiàn)象）。

三、實(shí)驗(yàn)程序

   （一）操作方法

  1.儀器和薄膜的準(zhǔn)備

（1）酸酸纖維薄膜的剪裁和準(zhǔn)備：醋酸纖維膜分成有光澤和元光澤面兩面，選擇無光澤一面，距離邊沿1.5cm處劃一條直線，然后把薄膜剪成2×8cm,將裁好的薄膜無光澤面朝下，漂浮巴比妥緩沖液上，若漂浮的薄膜在15~30S內(nèi)迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，可以用于電泳。讓膜自然下沉，待膜*浸透約0.5h后取出，夾在清潔的濾紙中間輕輕吸去多余的緩沖液，同時(shí)分辨光澤面和無光澤面。

（2）制作濾紙橋：剪裁尺寸合適的濾紙條，取雙層附著在電泳槽的支架上。使它的一端與支架前沿對齊，另一端浸入電極槽的緩沖液內(nèi)，然后用緩沖液將濾紙全部潤濕并驅(qū)除氣泡，使濾紙緊貼在支架上，即為“濾紙橋”。按照同樣的方法，在另一個(gè)電極槽的支架制作相同的濾紙橋。它們作用是聯(lián)系醋酸纖維薄膜和兩極緩沖液之間的橋梁。

（3）平衡：用平衡裝置，使兩個(gè)電極槽內(nèi)緩沖液的液面彼此處于水平狀態(tài)，一般需要平衡15~20min。

2.點(diǎn)樣

在薄膜無光澤的一面點(diǎn)樣。點(diǎn)樣在距負(fù)1.5cm處。點(diǎn)樣時(shí)，用玻璃片沾上血清，先在濾紙上練習(xí)點(diǎn)樣，使血清均勻分布在點(diǎn)樣區(qū)，形成具有一定寬度，粗細(xì)勻稱的直線，試點(diǎn)熟練之后，開始點(diǎn)在醋酸纖維薄膜上。

3. 電泳

用鑷子將目點(diǎn)樣端的薄膜平貼在電泳槽負(fù)極支架的濾紙橋上，另一端平貼于正極，薄膜要緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。

4. 染色

電泳完畢立即取出薄膜，直接浸入染色液中染色5min，取出后用漂洗液浸洗脫色，每隔10min左右換一次漂洗液，連續(xù)更換3次，可使背景顏色脫去，將膜夾于干凈的濾紙中，用電吹風(fēng)的冷風(fēng)將膜吹干。操作中，要注意控制染色和漂洗的時(shí)間，防止背景過深或某些區(qū)帶太淺。

5. 結(jié)果判斷

一般在染色后的薄膜上可顯現(xiàn)清楚的五條區(qū)帶。從正起，依次為清蛋白，a1球蛋白，，a2球蛋白，β球蛋白和r球蛋白。

6. 透明

取一條漂洗清楚的電泳薄膜，待干燥后浸入透明液中約5min,取出平貼于玻璃板上，使*干燥，即成透明膜，電泳圖譜仍清晰可見，可以長期保存。

7. 定量洗脫法

用洗脫法測定各蛋白質(zhì)組分的相對百分含量。將電泳圖譜的各區(qū)帶剪下，分別浸于盛有0.4mol/L NaOH溶液的試管中，清蛋白管加入4ml氫氧化鈉溶液，其余每管加2ml氫氧化鈉溶液，揺勻，放入37℃恒溫水浴中浸提30min，每隔10min充分搖動(dòng)一次，以便將色澤*洗脫下來。該溶液顏色較穩(wěn)定，在室溫下24h內(nèi)顏色強(qiáng)度無顯著變化，然后在620nm波長處比色，測定各管的光吸收值。分別計(jì)算血清各部分蛋白質(zhì)所占百分率。

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