一、實(shí)驗(yàn)原理

凝膠層析又稱排阻層析、分子篩層析和凝膠過濾。凝膠是由膠體溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì)，其內(nèi)部具有很細(xì)微的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠層析的機(jī)理是分子篩效應(yīng)。凝膠顆粒在合適溶劑中浸泡，充分吸液膨脹，然后裝入層析柱內(nèi)，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫。在洗脫過程中大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而沿凝膠顆粒間的空隙先流出柱外，而小分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，流速緩慢，以致后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質(zhì)按順序分離開。

目前使用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠和瓊脂糖與葡聚糖組成的復(fù)合凝膠。本實(shí)驗(yàn)用的是葡聚糖凝膠，是由多聚葡萄糖與環(huán)氧化氯丙烷通過交聯(lián)反應(yīng)制成的有孔顆粒狀凝膠。

根據(jù)凝膠層析的原理，對(duì)同一類型化合物，其洗脫特征與組分的相對(duì)分子質(zhì)量有關(guān)，流過凝膠柱時(shí)，按分子大小順序流出，相對(duì)分子質(zhì)量大者走在前面。通常以對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)作圖可得一曲線，稱“選擇曲線”，曲線斜率是凝膠性質(zhì)的一個(gè)重要特征，在一定范圍內(nèi)，曲線愈陡分級(jí)愈好。在測(cè)定末知物的相對(duì)分子質(zhì)量時(shí)，以使用曲線的直線部分為宜。

二、實(shí)驗(yàn)用品

（一）器材

（1）層析柱：1.1×100cm。

（2）核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀或紫外分光光度計(jì)。

（3）自動(dòng)部分收集器，恒壓瓶，口瓶。

（二）試劑  

（1）Sephadex G-75。

（2）5% Ba(AC)₂。   

（3)洗脫液：0.025mol/L　Kcl０.２ｍｏｌ／Ｌ　乙酸溶液。

（4）藍(lán)色葡聚糖－２０００（２mｇ／ｍｌ）。

（5）Ｎ－乙酰酪氨乙酯（１～２ｍｇ／ｍｌ）。

（6）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合液（各２～３mg／ｍｌ，用Kcl－乙酸溶液配制）；包括牛血清白蛋白，雞卵清蛋白，胰凝乳蛋白酶原和結(jié)晶牛胰島素，均需層析純。

（三）材料

牛血清白蛋白，雞卵清蛋白，胰凝乳蛋白原A，結(jié)晶牛胰島素，以上材料均需層析純。

三、實(shí)驗(yàn)程序

（一）操作方法

 1.一般操作方法

（１）凝膠的選擇和處理：凝膠顆粒大小均勻。對(duì)于顆粒不均勻的凝膠，可將其懸浮于大體積的水中，讓其自然沉降，在一定時(shí)間之后，用傾瀉法除去懸浮的過細(xì)顆粒。

將稱好的凝膠干粉傾入過量的洗脫液中，室溫下放置，使之充分溶脹。注意不要過分?jǐn)嚢?，以防顆粒破碎。溶脹時(shí)間因凝膠交聯(lián)度不同而異。為了縮短溶脹時(shí)間，殺死細(xì)菌和霉菌，排除凝膠內(nèi)氣泡，可在沸水浴上加熱。

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