western blot 之發(fā)光鑒定

一般使用辣根過氧化物酶 HRP-ECL 發(fā)光法或堿性磷酸酶 AP-NBT/BICP 顯色法。

1．HRP-ECL 發(fā)光法：

將 A、B 發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于 A、B 混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5 min 左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見熒光強度曝光。取出膠片立即*浸入顯影液中 1～2 min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片*定影，清水沖凈晾干，標定 Marker，進行分析與掃描。

2．AP-NBT/BICP 顯色法：

每片 NBT/BICP 可溶解于 30 ml 水中，使用前將一片分裝在 30 個 EP 管中，每張 3×9 cm 的膜取一管配成 1 ml 即可。將 PBST 或 TTBS 洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于 NBT/BICP 溶液液滴上，并用不透明物體（如報紙）遮擋光線，顯色 20 s 后每 10 s 觀察一次，至條帶明顯或有本底出現(xiàn)時將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。

注：背景深淺與一抗的質(zhì)量及二抗的量有關(guān)，當然如果暴光時間長達半小時，出現(xiàn)背景是正常的。