慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 返回列表頁(yè)

一、技術(shù)定義與核心價(jià)值

慢病毒轉(zhuǎn)染是利用改造后的慢病毒載體將外源基因遞送至靶細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)的基因?qū)爰夹g(shù)。其核心優(yōu)勢(shì)包括：

1. 廣譜細(xì)胞適用性：可感染分裂細(xì)胞與非分裂細(xì)胞（如神經(jīng)元、干細(xì)胞、原代細(xì)胞），突破傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染限制 。

2. 高效整合表達(dá)：病毒RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為DNA后整合至宿主基因組，實(shí)現(xiàn)外源基因的yong久性表達(dá) 。

3. 低免疫原性：刪除病毒致病基因（如HIV的 tat、rev），顯著降低宿主免疫反應(yīng) 。

4. 操作便捷性：無(wú)需復(fù)雜轉(zhuǎn)染試劑，通過(guò)病毒顆粒直接感染細(xì)胞 。

術(shù)語(yǔ)辨析：

• 轉(zhuǎn)染（Transfection） ：通常指非病毒介導(dǎo)的核酸導(dǎo)入（如電穿孔、脂質(zhì)體）。

• 轉(zhuǎn)導(dǎo)（Transduction） ：特指病毒介導(dǎo)的基因傳遞，慢病毒技術(shù)屬于此類 。

二、分子機(jī)制：從病毒包裝到基因整合

（一）慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)成

（二）宿主細(xì)胞內(nèi)的基因遞送流程

1. 病毒進(jìn)入：VSV-G蛋白結(jié)合靶細(xì)胞膜受體（如LDLR），介導(dǎo)膜融合 。

2. 逆轉(zhuǎn)錄與入核：病毒RNA在胞質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)整合前復(fù)合體（PIC）轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi) 。

3. 基因組整合：病毒整合酶（Integrase）將cDNA隨機(jī)插入宿主染色體，實(shí)現(xiàn)yong久性表達(dá) 。

三、標(biāo)準(zhǔn)操作流程與技術(shù)優(yōu)化

（一）病毒包裝與純化（以293T細(xì)胞為例）

（二）靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選

1. 感染條件優(yōu)化：

• 添加聚凝胺（Polybrene，8μg/mL）增強(qiáng)病毒吸附 。

• 感染復(fù)數(shù)（MOI）測(cè)試：通常MOI=5-20（根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)整） 。
  

   

2. 穩(wěn)定株篩選：

• 抗生素篩選：嘌呤霉素（1μg/mL）處理7-14天，清除未轉(zhuǎn)染細(xì)胞 。

• 單克隆擴(kuò)增：有限稀釋法獲得均一性細(xì)胞株 。

關(guān)鍵技巧：

• 非分裂細(xì)胞（如神經(jīng)元）需延長(zhǎng)感染時(shí)間至72小時(shí) 。

• 原代細(xì)胞建議使用低MOI（≤5）避免毒性 。