原核注射實(shí)驗(yàn) 返回列表頁

一、技術(shù)定義與核心原理

原核注射是將外源DNA直接注入受精卵的雄性原核（體積較大且易定位），使外源基因隨機(jī)整合至宿主基因組的技術(shù)。其核心機(jī)制包括：

1. 隨機(jī)整合：外源DNA通過非同源末端連接（NHEJ）插入染色體，整合位點(diǎn)與拷貝數(shù)不可控。
   

    

2. 原核優(yōu)勢(shì)：雄性原核（由精子形成）比雌性原核更易定位，且DNA修復(fù)活性高。

3. 瞬時(shí)表達(dá)窗口：受精卵處于單細(xì)胞期，DNA修復(fù)系統(tǒng)活躍，利于外源片段整合。

生物學(xué)基礎(chǔ)：
受精后12-24小時(shí)為最佳操作窗口（小鼠），此時(shí)原核清晰可見。

二、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程

（一）前期準(zhǔn)備

（二）注射與胚胎移植

• 存活率控制：注射后受精卵存活率需＞80%。

• 移植時(shí)機(jī)：發(fā)育至2細(xì)胞期再移植，可提高著床率。

（三）首建鼠（Founder）鑒定

1. 基因型檢測(cè)：

• PCR法：提取鼠尾DNA，擴(kuò)增外源基因。

• Southern Blot：驗(yàn)證拷貝數(shù)與整合完整性。

2. 表達(dá)驗(yàn)證：

• Western Blot（蛋白水平）或RT-PCR（轉(zhuǎn)錄水平）。

首建鼠特性：
每只Founder為獨(dú)立品系（因隨機(jī)整合位點(diǎn)不同），需分別建系。