基因敲除技術(shù)

CRISPR技術(shù)

一、服務介紹

原核生物規(guī)律成簇的間隔短回文重復（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）是細菌和古細菌為應對病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機制。CRISPR/Cas是新出現(xiàn)的一種由RNA指導Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術(shù)。在這一系統(tǒng)中，crRNA（CRISPR derived RNA）通過堿基配對與tracrRNA（trans-activating RNA）結(jié)合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復合體指導Cas9蛋白在crRNA引導序列靶定位點剪切雙鏈DNA達到對基因組DNA進行修飾的目的。目前，CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成功應用于大小鼠基因的KO/KI模型制備。

二、基因敲除技術(shù)服務流程

1、gRNA載體構(gòu)建

2、gRNA和Cas9體外轉(zhuǎn)錄成mRNA

3、mRNA顯微注射（F0模型生產(chǎn)）

4、F1模型生產(chǎn)

三、CRISPR/Cas9技術(shù)特點和優(yōu)勢

1、可實現(xiàn)對靶基因多個位點同時敲除。

2、實驗周期短，順利情況下僅需2個月。

3、無物種限制。

TALEN靶向敲除技術(shù)

一、服務介紹

TALEN（transcription activator-like (TAL) effector nuclease）技術(shù)是基于對DNA識別的TALEN臂和人工改造的核酸內(nèi)切酶的切割域（Fok I）的結(jié)合對細胞基因組進行修飾而實現(xiàn)的。TAL的核酸識別單位由34個氨基酸組成，其與DNA序列結(jié)合的特異性取決于第12位和第13位氨基酸殘基（重復可變的雙聯(lián)氨基酸位點，RVDs）。RVDs和A、T、C、G就恒定的對應關(guān)系，即NI識別A、NG識別T、NN識別G、HD識別C。因此，要識別特定的核酸序列，只需將TAL識別模塊按照對應的核苷酸序列串聯(lián)組裝即可，通常會在目的基因中選擇兩處相鄰（間隔15-20個堿基）的靶序列（長度為16-20bp的DNA序列）分別進行TALE識別模塊的構(gòu)建。通過DNA識別域結(jié)合到靶位點上，以及FokI的切割域形成二聚體后，可特異性對目標基因DNA實現(xiàn)切斷。在非同源末端連接修復過程中，DNA雙鏈斷開后會由于堿基的隨機增減造成目標基因功能缺失。該技術(shù)目前已成功應用于植物、細胞、酵母、斑馬魚及大、小鼠等各類模式動物的研究領(lǐng)域。

二、服務流程

1、設計、構(gòu)建TALEN質(zhì)粒

2、TALEN質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄成mRNA

3、mRNA原核顯微注射（F0小鼠生產(chǎn)）

4、F1小鼠生產(chǎn)

三、技術(shù)特點

1、無基因序列、細胞、物種限制，可敲除大部分基因。

2、實驗設計簡單準確、實驗周期短、成本低。

3、毒性低、脫靶情況少；成功率高。

4、TAL的核酸識別單元與A、G、C、T有恒定的對應關(guān)系。

5、可識別給到的目標基因序列，且不受上下游序列影響。